Mechanoreceptor Piezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation

Keywords: CREB; Conjunctival epithelial cells; Inflammation; Mechanical stress; Neutrophils; Piezo1; p38 MAPK.

据报道，揉眼睛会显著恶化各种眼部疾病。长期过度揉眼时对角膜产生的机械压力导致角膜变薄，这种情况称为圆锥角膜。许多研究强烈表明，圆锥角膜可能是一种炎症性疾病。眼部炎症是一种多方面的反应，通常由各种刺激物引发。常见的过敏原和病原体，如花粉、宠物皮屑、真菌、尘螨和病毒，以及烟雾和化学物质等环境刺激，都会在眼表引发免疫反应。

圆锥角膜患者和佩戴隐形眼镜人群的泪液研究（隐形眼镜被认为会对眼表组织产生机械应力）已经确定了促炎细胞因子水平的升高，如白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和基质金属蛋白酶-9 （MMP-9）。重要的是，研究已经证明，揉眼本身会急性诱导正常受试者泪液中IL-6、IL-8 和 TNF-α 等细胞因子的释放，这些细胞因子在眼表炎症中起着至关重要的作用。因此，由摩擦眼睛和佩戴隐形眼镜引起的机械应力有可能通过激活机械敏感离子通道在眼表诱导炎症反应。

Piezo蛋白家族之一，Piezo1 主要在非神经元组织中表达，可以感知各种应力，包括压应力、拉伸应力和剪切应力等，并参与调控血管发育、血管收缩、红细胞体积等诸多生理过程。最近的研究报道表明，Piezo1 通道通过诱导机械应力驱动的细胞因子产生，与炎症反应和各种病理状况有关，突出了它们在机械感觉之外的作用。然而，Piezo1 在眼部组织中的功能及其与眼部炎症的关系仍不清楚。

近日，日本昭和大学医学研究生院生理学系及眼科系课题组在最新研究中阐明了机械应力可诱导或加重眼部炎症这一先前怀疑但尚未明确的现象，并重点关注了 Piezo1 通道在结膜上皮细胞中的作用及其潜在机制。研究成果发表于 The Ocular Surface 期刊题为“Mechanoreceptor Piezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation”。
首先，检查了机械敏感的 Piezo1 通道的激活是否会改变炎性细胞因子的表达。将Piezo1 特异性激动剂 Yoda1 和几种过敏原应用于培养的人结膜上皮细胞（HConjECs），发现 Yoda1 明显将 HConjECs 中的 IL-6 和 IL-8 mRNA 水平提高到与真菌提取物 （Alternaria alternata）诱导的水平相似。在诱导白细胞介素表达的药物中，Yoda1 和真菌提取物都激活了信号蛋白 p38 MAPK 和转录因子 CREB。这些数据表明，机械敏感的 Piezo1 通道的激活可以在 HConjECs 中诱导炎性细胞因子，如 IL-6 和 IL-8，其水平与真菌提取物通过常见的细胞内信号通路诱导的水平相似。

然后，确定功能性 Piezo1 通道是否在 HConjECs 中表达。RT-PCR 和 Western blot 分析清楚地表明 HConjECs 表达 Piezo1 通道。细胞内 Ca2+ 的成像显示，在 Yoda1 刺激 Piezo1 通道后，[Ca2+]i立即显著增加。与 IL-6 表达和 p38 MAPK/CREB 的激活相同，在测试的过敏原中，只有真菌提取物诱导 [Ca2+]i 显著升高，进一步支持其是共享信号通路。这表明，HConjECs 表达一个功能性机械敏感的 Piezo1 通道，该通道在介导细胞内 Ca2+ 信号传导和炎症反应中起关键作用。

为了证实通过Piezo1通道和p38 MAPK和CREB激活的 Ca2+ 内流参与IL-6上调，使用p38 MAPK 特异性抑制剂 SB203580 和 Ca2+ 螯合剂预处理 HConjECs，发现SB203580 成功阻断了p38 MAPK 的激活（图1 A、B）。重要的是，阻断 p38 MAPK 激活显著抑制了 Piezo1 通道激活诱导的 CREB 激活（图1 A-C）和 IL-6 蛋白/mRNA 上调（图1 D、E）。此外，BAPTA-AM 通过螯合细胞内Ca2+ 显著降低了 Yoda1 诱导的 IL-6 mRNA 上调（图1 F）。这些数据表明，活化的 Piezo1 通道通过 Ca2+ 内流和 p38 MAPK-CREB 通路的激活来诱导 IL-6 表达。

图1 p38 MAPK 的激活和 [Ca2+]i 的升高对 Yoda1 诱导的 IL-6 上调至关重要。

免疫细胞化学分析显示，p38 MAPK 和 CREB 在 Yoda1 处理后 15 分钟被显著激活（磷酸化），并在 HConjECs 的细胞核中发现（图2 A、B）。在 Piezo 通道激活后 6 小时，还观察到 IL-6 蛋白表达细胞激增（图2 C）。IL-6 的免疫反应性与顺式高尔基体标志物 GM130 共定位（图2 D），这种共定位表明，观察到的 IL-6 蛋白是响应 Yoda1 刺激新合成的。SB203580 预处理后，p38 MAPK 和 CREB 的激活以及IL-6 蛋白的表达明显减少（图2 A、B、C）。这些数据表明，Piezo1 通道的激活诱导 p38 MAPK 磷酸化及易位到细胞核，随后刺激 CREB 激活和 IL-6 上调。

接下来，为了确认 Piezo1 在 Yoda1 诱导的信号传导中的功能作用，敲低 HConjECs 中 Piezo1 的表达。结果表明，Yoda1 处理对照细胞中 [Ca2+]i升高及 p38 MAPK 和 CREB 磷酸化，这在 PIEZO1 敲低细胞中被显著抑制。此外，PIEZO1 敲低显著降低了 Yoda1 诱导的 IL-6 mRNA 表达的上调。这些数据表明，HConjECs 中Yoda1 诱导的 [Ca2+]i 升高、细胞核 p38 MAPK/CREB 激活和 IL-6 上调严重依赖于 Piezo1。

图2 Piezo1 激活显著诱导 HConjECs 中磷酸化-p38 MAPK 和磷酸化-CREB 的核表达以及 IL-6 蛋白的胞质表达，这严重依赖于 p38 MAPK 激活。

进一步地，实验确定了机械刺激是否真的导致了 Yoda1 依赖性 Piezo1 通道激活诱导的现象。将培养的 HConjECs 拉伸至 120 %，发现拉伸刺激诱导 p38 MAPK-CREB 通路在没有Yoda1处理的情况下以细胞外 Ca2+ 依赖的方式激活（图3 B、C）。在 HConjECs 中拉伸刺激 6 小时后也证实了 IL-6 上调，其被SB203580 阻断（图3 D）。GsMTx4 是一种机械敏感的离子通道抑制剂，可显著抑制拉伸诱导的 p38 MAPK、CREB 的激活和 IL-6 mRNA 表达，但未完全抑制这些反应（图3 E-H）。这些数据表明，HConjECs 中机械刺激通过 [Ca2+]i 升高和 p38 MAPK/CREB 激活诱导IL-6表达。

图3 机械拉伸刺激诱导 HConjECs 中 p38 MAPK/CREB 激活和 IL-6 上调。

最后，实验旨在确定大鼠结膜上皮中 Piezo1 受体的激活是否显示出与体外培养的 HConjECs 中观察到的现象相似。将 Yoda1 滴注到眼睛 5-10 分钟后，观察到大鼠结膜上皮中磷酸化-p38 和磷酸化-CREB 的表达显著增加。Piezo1 通道激活后 3 小时，IL-6 免疫反应性也显著增加。这些数据证实，Piezo1 激活上调大鼠结膜上皮中的 p-p38 MAPK、p-CREB 和 IL-6水平，与体外培养的 HConjECs 现象相似。

此外，还观察到大鼠结膜上皮中 Piezo1 受体刺激后 24 小时，中性粒细胞、髓过氧化物酶（MPO）阳性细胞的数量显著增加。然而，在将 Yoda1 滴注到眼睛后 3 小时和 24 小时，嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白（MBP）阳性细胞的数量没有变化。这些数据表明，结膜中 Piezo1 通道的激活诱导中性粒细胞浸润到结膜上皮细胞，而不影响嗜酸性粒细胞浸润。

图4 图形概要

机械敏感的 Piezo1 通道的激活通过升高 [Ca2+]i 以及 p38 MAPK 和转录因子 CREB 的激活诱导结膜上皮细胞中IL-6的表达。机械应力通过它刺激 Piezo1 通道和 Ca2+ 内流，诱导 p38 MAPK 的激活。转录因子 CREB 在 p38 MAPK 激活后被磷酸化，然后促进 IL-6 转录。

几乎每个人都知道我们不应该揉眼睛，并经常把这个建议归因于不干净的手指有感染的风险或对眼表存在潜在损害。然而，该研究表明，揉眼可以诱导结膜中炎性细胞因子的产生，导致中性粒细胞浸润。中性粒细胞浸润的结果以及 Piezo1 激活后观察到的细胞反应与真菌暴露引发的结果相似，这表明结膜的机械刺激可以引发类似于感染的炎症反应。这意味着感染引起的眼痒可能会促使揉眼，从而增强炎症防御机制。然而，该研究与其他研究的结果表明，习惯性揉眼或过敏症状引起的过度揉眼会导致过度活跃的炎症反应，增加患上或加剧眼部炎症或炎症相关疾病（如圆锥角膜）的风险。因此，提高对持续揉眼风险的认识对于预防眼部炎症的发生和进展至关重要。

参考文献：Fukuoka S, Adachi N, Ouchi E, Ikemoto H, Okumo T, Ishikawa F, Onda H, Sunagawa M. Mechanoreceptor Piezo1 channel-mediated interleukin expression in conjunctival epithelial cells: Linking mechanical stress to ocular inflammation. Ocul Surf. 2025 Jan 6;36:56-68. doi: 10.1016/j.jtos.2025.01.001. Epub ahead of print. PMID: 39778715.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39778715/

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