在神经科学研究中，逆行神经元追踪技术是解析复杂神经环路的关键工具。自19世纪高尔基染色技术开创神经解剖学研究以来，科学家们不断探索更精准的标记方法。Fluoro-Gold（FG）作为目前最常用的荧光逆行示踪剂，凭借其高亮度、抗光漂白性及细胞质特异性标记能力，成为神经环路研究的“金标准”。然而，传统宽场荧光显微技术受限于轴向分辨率不足，无法实现深层组织的三维成像；而共聚焦显微镜因紫外激发需求与穿透深度限制，难以满足活体或厚组织样本的高分辨需求。

双光子激发显微技术（2PEM）通过近红外飞秒激光激发荧光分子，突破了光学穿透深度与空间分辨率的瓶颈，但其在FG成像中的应用长期未被系统研究。基于《Scientific Reports》最新研究成果，解析FG的双光子激发光谱与荧光寿命特性，揭示其在深层神经成像中的突破性应用，为神经退行性疾病研究与神经再生医学提供全新视角。

研究背景与技术挑战
逆行示踪剂的演进与FG的生物学特性
从早期的辣根过氧化物酶到现代荧光染料，逆行示踪技术的发展始终围绕提升标记特异性与成像效率。FG的活性成分羟基芪巴脒（OHSA）通过轴突末端摄取并逆行运输至胞体，在溶酶体中富集形成稳定标记。其荧光特性受pH调控：中性环境发射黄色荧光，酸性条件下蓝移。这种特性使其在活体与固定组织均能保持高信噪比，但传统紫外激发方案限制了其与现代显微平台的兼容性。

技术创新与应用
双光子激发光谱的首次表征
研究团队通过可调谐钛宝石激光器（720-990 nm）系统测量了FG的双光子激发光谱。结果显示，FG在720 nm处呈现最大激发效率，与其单光子紫外吸收峰（350 nm）呈近似倍频关系。这一发现填补了FG光学特性的空白，为双光子成像参数优化提供了直接依据。值得注意的是，在脑组织背景下，760 nm激发可最大化FG与自发荧光的信噪比，提示波长选择需兼顾组织光学特性。

成像实验与结果分析
高分辨率三维重建与亚细胞结构解析
在面神经运动核标记实验中，双光子成像清晰展现了神经元胞体、树突及胞内囊泡结构。相较于宽场成像的模糊轮廓，2PEM可分辨直径<1 μm的树突棘，为突触可塑性研究提供形态学量化基础。通过机器学习驱动的三维分割算法，研究者实现了自动化的细胞计数与空间分布统计，效率较传统切片法提升十倍以上。

总结与展望
FG的双光子特性表征标志着神经成像技术的重要突破。通过优化激发波长（720 nm）与折射率匹配方案，研究者实现了哺乳动物全脑干尺度的高分辨三维成像，并结合FLIM技术解决了复杂生物样本中的信号串扰问题。这些进展不仅提升了逆行示踪实验的效率和精度，更为神经再生、疼痛环路解析及退行性疾病机制研究开辟了新路径。随着双光子显微系统的小型化与高通量化，此类技术有望从基础研究走向临床病理诊断，例如术中神经束定位或神经移植效果评估。

DOI:10.1038/s41598-021-97562-3.