靶向药物递送是现代医学的重要研究方向，通过将药物精准输送至病灶部位，显著提升药物治疗效果，同时减少药物用量、降低副作用。然而，靶向递送系统的开发面临诸多挑战，包括如何在不影响健康组织的前提下将药物递送到特定组织或细胞，以及应对生物屏障、免疫清除、局部控制药物释放和在不引起不良反应的情况下保证药物生物相容性与安全性等问题。  

细胞外囊泡（EVs）因其天然的来源、优异的生物相容性、可运输多种分子以及组织靶向性而被认为是理想的药物递送载体。然而，EVs 的组织特异性及来源细胞对 EVs 生物分布的影响尚未完全明确，且由于其异质性强、尺寸微小以及半衰期短，很难系统地开展针对 EVs 的生物分布和组织趋向性的研究。因此，如果有一种方式可以监测和量化体内 EVs 的生物分布，这将极大地促进该领域的发展。

2025年1月16日，阿斯利康位于瑞典的研发团队在 Advanced Science 上发表了一篇题为“Barcoded Hybrids of Extracellular Vesicles and Lipid Nanoparticles for Multiplexed Analysis of Tissue Distribution”的研究论文。该研究开发出一种 EVs 与携带单链 DNA 条码（DNA Barcode）的 LNPs 融合的技术，利用 DNA 条形码作为区分不同来源 EVs 的依据，创建了独特的带有条形码的杂交 EV 颗粒（hybrid EV particle, hEV）文库，实现了在单个体内实验中同时追踪多种 EVs，这一方法能够高效地获取大量的 EVs 生物分布数据，为绘制组织趋向图和识别潜在的组织特异性药物递送载体提供了有力工具，对靶向药物递送领域的研究具有重要意义。

一、hEVs 的综合表征
本研究开发了一种 pH 依赖的方法，通过控制 EVs 与 LNPs 在酸性环境中融合，成功制备了 hEVs。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，EVs 粒径平均值为 117 nm，LNPs 为 67 nm，而融合后的 hEVs 在 174 nm 处出现额外峰（图1d），表明 EVs 与 LNPs 发生融合。透射电子显微镜结合免疫金标记进一步确认了 EVs 标记物 CD81 和 CD63 与 LNPs 组分 PEG 共存于同一颗粒上（图1f）。Western blotting 对细胞、EVs 和 hEVs 样品的蛋白质分析结果进一步证实这种 pH 依赖的方法成功制备了 hEVs。此外，利用 NanoFCM 的单分子检测能力验证条码封装效率，结果显示，hEVs 的条码封装效率为 60%，而 LNPs 的封装效率超过 98%（图1e）。综上所述，这些结果表明开发的 pH 依赖法能够实现 hEVs 的合成，并通过与 LNPs 融合使其装载 DNA 货物。

图1. 杂交细胞外囊泡（hEVs）的形成与表征

二、不同来源 hEVs 条码唯一性分析
研究者选取了 16 种不同细胞系（涵盖肝、肺、胰腺、结肠、肌肉、血液、乳腺、宫颈和干细胞等，见下表），以研究 EVs 在体内的分布。通过粒径和浓度分析，发现不同细胞系的 EVs 产量和大小存在差异，但细胞数量与 EVs 产量之间并无相关性（图2b）。随后，研究者对源自不同细胞系的 EVs 进行唯一条码标记，构建了带有独特条码的 hEVs 库，并评估了 DNA 条码的装载效率，结果显示不同细胞系来源的 hEVs 的 DNA 装载效率存在很大差异（图2d）。

进一步地，通过 NanoFCM 评估 hEVs 在存储过程中的稳定性及相互融合的潜力。首先，用 PE-TopFluoro AF488 分别标记 Expi293F hEVs 和 HAP1 hEVs，同时在 HAP1 hEVs 中装载 Cy5 标记的 mRNA（Cy5阳性率为35%），将 Expi293F-AF488 hEVs 和 HAP1-Cy5 hEVs 以1：1的比例混合共孵育。结果显示，双阳颗粒比例仅为 2.4%（图2f, g），表明异源 hEVs 在孵育期间保持稳定。同源的 hEVs 混合后的双阳颗粒占 7.2%（图2f, g），这表明同类型粒子之间可能存在一些内在的相互作用。此外，基于 NanoFCM 超高的荧光灵敏度和荧光触发模式，还发现 hEVs 中存在游离的 mRNA（图2g），这些成分可能会吸附在未染色的颗粒上，从而导致双阳颗粒的计数被高估。上述结果表明，hEVs 之间融合或依赖于特定类型，且在多路实验中条码交换的风险较低。

图2. 不同细胞系 EVs 唯一条码标记和稳定性评估

三、hEVs 的体内生物分布
为了验证 hEVs 是否能够实现高通量体内生物分布分析，通过尾静脉给药研究混合 hEVs 在小鼠体内的生物分布，给药 1h 后根据下图3a的均质化方法准备高通量测序分析（NGS）样品。hEVs 体内分布显示，肝脏是大多数颗粒富集的主要目标，而大脑和心脏组织是所有粒子最难到达的部位，说明本研究开发的方法可以快速研究 hEVs 的生物分布。值得注意的是，57% HAP1 hEVs 在肺部富集，证实 HAP1 hEVs 具有突出的肺部靶向潜力（图3b）。

图3. 不同来源 hEVs 的体内生物分布分析

四、hEVs 的功能性递送
为了评估 HAP1 hEVs 在体内的递送能力，研究者将负载 Cre mRNA 的 HAP1 hEVs  注射到 Cre 报告小鼠中，并于 4 天后通过 D-luciferin 成像检测不同组织中的荧光素酶活性。结果显示，在肝脏、脾脏和肺部观察到荧光素酶活性，其中肝脏活性最高，脾脏和肺部次之（图4e, f）。进一步的免疫组化分析表明，HAP1 hEVs 主要在肺部的亚上皮区域被细胞摄取，且未观察到与小血管附近的细胞摄取，这表明 HAP1 hEVs 能够离开血管并穿透肺组织（图4g, h, i）。综上结果表明，条码 hEVs 可以用于快速研究 EVs 的体内分布，并有潜力成为精准靶向的药物递送载体。
 

图4. HAP1 hEVs 实现 mRNA 向肺部的功能性递送

结论
本研究开发的条码 hEVs 技术为 EVs 的生物分布研究提供了一种高通量、多路复用的新方法，能够快速分析不同来源 EVs 的组织趋向性，有助于加速 EVs 作为药物载体的研究和开发。此外，发现并证实了 HAP1 hEVs 的肺部趋向性，为开发针对肺部疾病的靶向药物提供了新的思路和工具。该技术有望进一步优化，以提高 EVs 的靶向效率和功能性药物的递送能力，为个性化医疗和精准医学提供新的策略。

展望
NanoFCM 凭借其超高灵敏度和高通量检测能力，在单颗粒水平对 hEVs 进行了全面表征，提供包括 hEVs 的粒径分布、浓度、装载效率和游离核酸比例等多维信息。这些详尽的数据为深入探究 hEVs 生物分布以及绘制组织趋向图提供了有力支持，进而推动了 EVs 作为药物载体的进一步开发和产业化应用。