小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)是由细胞分泌的纳米级脂膜囊泡，其表面覆盖着一层聚糖。这层聚糖不仅维持了sEVs的表面特性，还参与了包括细胞摄取、免疫调控及癌症发展等关键生理和病理过程。唾液酸(sialic acids, SAs)作为聚糖链末端的酸性九碳糖，因其位置特殊性成为感知胞外环境的“前哨分子”，在调控细胞间相互作用、病原体识别以及表面电荷分布中发挥关键作用。尽管sEVs相关的蛋白和核酸已被广泛研究，但其聚糖修饰的研究仍亟待深入探索。鉴于sEVs亚群的高度多样性及其功能特异性，单颗粒水平的表征解析其组成和生物学功能具有重要意义。2024年7月24日，厦门大学化学化工学院颜晓梅教授课题组在Analytical Chemistry上发表了一篇题为：“Surface Sialic Acid Detection of Small Extracellular Vesicles at the Single-Particle Level by Nano-Flow Cytometry”的研究论文，报道了基于自主研发的纳米流式检测装置(nano-flow cytometer, nFCM)实现单颗粒水平sEVs表面唾液酸原位标记和分析的新方法。

一、PALEV-nFCM方法开发
本研究受温和偏高碘酸钠氧化联合苯胺催化的肟连接(periodate oxidation and aniline-catalyzed oxime ligation, PAL)策略的启发，开发了一种针对小细胞外囊泡表面唾液酸的特异性化学标记方法(PALEV)，并结合nFCM技术，实现了在单颗粒水平对sEV表面衍生化SAs分布的检测。首先，通过超速离心法从正常结肠成纤维细胞系CCD-18Co中分离出sEVs，并利用透射电子显微镜(TEM)确认其典型囊泡形态（图1A）。nFCM分析显示粒径主要分布于40-200 nm（图1B）。此外，Western Blot验证了sEVs中存在经典的sEV标志物CD9和TSG101，而无内质网(ER)标志物Calnexin（图1C）。综上结果表明，CCD-18Co sEVs的回收率和纯度均满足后续分析需求。

基于PALEV策略，首先通过温和的过碘酸盐氧化在SA的C-7位点引入醛基，随后利用苯胺催化醛基与XFD488羟胺荧光染料的肟连接反应（图1D）。最终，通过nFCM检测XFD488阳性比例和平均荧光强度(MFI)。结果显示，在最优条件下，XFD488阳性sEVs的比例与经典凝集素标记法相当（图1E-H），且MFI显著提升，证实了该策略的高效性。

图1. PALEV-nFCM法对sEVs表面SAs的标记与表征

二、PALEV-nFCM方法可靠性验证
为了验证PALEV标记方法的可靠性，研究者合成了含不同比例DSPE-PEG2k-SA的脂质体（100 nm）模型（图2A(i)）。结果显示，随着DSPE-PEG2k-SA摩尔比的增加，XFD488+脂质体的比例逐渐上升，最高可达94.0%（图2A-B），与Triton X-100法测定的纯度（93.5%）高度一致。此外，MFI分析表明，单个脂质体表面的SA含量与修饰浓度呈正相关（图2C-D）。

进一步，研究者将5% DSPE-PEG2k-SA修饰的脂质体与空白脂质体按不同比例混合，结果显示混合脂质体中SA修饰的比例与XFD488+比例之间呈现出高度的线性相关性（图2E-F），表明PALEV策略能够高效且定量地标记SA修饰的脂质体。

综上所述，PALEV-nFCM法可实现SA修饰的准确定量，为后续sEV的分析奠定基础。

图2. 脂质体模型验证PALEV标记方法的可靠性

三、PALEV-nFCM方法特异性验证
为了验证PALEV标记方法的特异性，研究者首先利用神经氨酸酶酶解末端SA残基。nFCM原始脉冲信号峰数据显示，酶处理组的侧向散射通道(SSC)和荧光通道(FL)的信号事件数(橙色星号)较未处理组显著减少（图3A），且XFD488+比例也呈现降低趋势（图3B）。这表明PALEV标记方法具有较高的特异性。

此外，研究者还观察到仅显示FL信号的零星事件（蓝色星号）。这些信号可能来源于共分离污染物或粒径过小的EV亚群。最新研究表明，TEM结合免疫金标记证明了共分离的伴随物质上存在糖类。这一发现强调了对整体平均方法所得数据进行谨慎解释的重要性，因为这些方法可能无法区分潜在的污染物贡献，而nFCM可以通过SSC触发排除此干扰。

进一步地，研究者对其他三种不同细胞系(HCT116、MRC-5和A549)的sEVs进行了唾液酸化状态分析。结果显示，这些细胞系的sEVs均表现出与CCD-18Co-sEVs相似的唾液酸化模式（图3C-D）。最后，研究者在细胞中加入唾液酸化代谢抑制剂(p-3Fax-Neu5Ac)，nFCM结果显示，XFD488+比例和MFI都显著降低（图3E-G），这进一步确认了该标记方法的特异性。

图3. PALEV标记方法的特异性评估

四、PALEV-nFCM方法普适性验证
研究者进一步将该方法应用于唾液和红细胞来源sEVs的SA分布分析。nFCM检测发现，相比于细胞来源的sEVs，唾液来源的sEVs具有较高的SA阳性比例（66.6%），且不同供体间的SA比例存在显著的个体差异（图4A-C），提示唾液酸化修饰在个体间具有高度异质性。

在RBC-sEVs分析中，研究者发现，钙离子载体刺激后，红细胞分泌的sEVs数量显著增加，且SA亚群比例以及单个sEVs的SA含量均明显上升（图4D-F）。与此同时，红细胞表面SA丰度同步下降。这些结果揭示了sEVs分泌与细胞表面糖基化调控的动态平衡机制。

综上结果表明，PALEV-nFCM方法具有广泛的适用性，不仅适用于合成的SA修饰脂质体，还适用于多种来源的sEVs，包括细胞培养上清、人唾液和人红细胞。此外，本研究首次在单颗粒水平系统地揭示了EVs表面聚糖修饰的高度异质性，不同来源sEVs的SA比例和强度均具有显著差异。

图4. PALEV标记方法的普适性验证

研究意义
本研究构建的PALEV-nFCM方法是糖链分析领域的一项重大突破，实现了在单颗粒水平对sEVs表面唾液酸的高通量、多参数定量分析。该方法突破了传统集群平均法的局限，为解析sEVs聚糖异质性及其功能关联提供了全新的技术手段。它不仅具有高特异性，还展示出广泛的适用性。它不仅深化了对sEVs生物学功能的理解，还为创新的诊断与治疗策略奠定了技术支持和理论基础。