一种细胞外囊泡通用标记方法之聚糖锚定荧光标记策略的研究与介绍
2025-07-11 来源:本站 点击次数:183在细胞外囊泡（EVs）的众多来源中，牛奶来源的细胞外囊泡（milk-derived extracellular vesicles, mEVs）因其来源丰富、具有天然的生物活性和生物相容性等特性，被视为有潜力的下一代治疗递送平台。mEVs 被开发用于口服药物递送的载体，保护治疗药物免受胃肠道降解，改善肿瘤的靶向治疗。然而，要充分挖掘 mEVs 的治疗潜力，需深入探究其细胞摄取行为及在细胞内的转运过程，这需要依赖可靠的标记技术。目前，常用的荧光标记方法存在诸多问题：例如，亲脂性染料标记存在染料脱落、自聚集、转移以及影响囊泡完整性等问题；常用的共价标记技术，如N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）酯染料标记，需要借助蛋白表面的伯胺，可能会改变囊泡表面蛋白的功能；基因工程标记则不适用于非培养来源的囊泡（如 mEVs），在实际应用中受到限制。因此，开发一种简单、稳定且对囊泡结构和功能影响较小的标记方法显得尤为关键。
日前，集美大学陈超翔教授团队在 Small Methods 发表题为“Glycan-Anchored Fluorescence Labeling of Milk-Derived Extracellular Vesicles for Investigating Their Cellular Uptake and Intracellular Fate”的文章，报道了一种“聚糖锚定”荧光标记策略。该策略通过氧化 mEVs 表面的唾液酸残基，与荧光染料共价连接，从而实现对 mEVs 的高效标记。经纳米流式（NanoFCM）分析证实该方法的标记效率近 100%，且 mEVs 的完整性和生物功能不受影响。这一创新的标记技术为深入研究 mEVs 的细胞摄取、细胞内转运机制以及药物递送效率提供了有力的支持，有望推动基于 mEVs 的新型药物递送系统的研发和临床应用。
01 聚糖锚定荧光标记策略
研究者通过高碘酸盐氧化 mEVs 表面的唾液酸产生醛基，再经苯胺催化与含酰肼功能化的荧光团（Cy5-酰肼）进行共价结合，实现荧光标记（图1a）。然后，利用 NanoFCM 对标记后的 mEVs 进行分析，荧光检测显示约 100% 的 mEVs 成功标记了 Cy5，证实该方法具有极高的标记效率（图1c, d）。同时，研究发现该标记不影响 mEVs 的物理性质、蛋白标志物和细胞摄取能力，且在不同温度和 pH 条件下稳定性良好，对多种来源的 EVs 均适用（图2）。
图1. NanoFCM 评估聚糖锚定荧光标记 mEVs 的效率
02 与亲脂性标记方法的对比
研究者利用 NanoFCM 对聚糖锚荧光标记方法与亲脂染料标记方法从标记效率、稳定性以及对囊泡特性的影响进行系统比较。结果显示，聚糖锚定标记法在所有测试的 mEVs 浓度下，均展现出近乎 100% 的标记效率，且不会引发囊泡的聚集或裂解（图3a-d），充分显示出该方法的高效性与稳定性。而亲脂性染料（如 DiD、PKH67、DiO）的标记效果则因浓度依赖性导致结果不稳定，低浓度时标记效率不足，高浓度则导致 mEVs 聚集、裂解和染料自聚集（图3）。
03 mEVs 的细胞摄取和胞内转运
研究者将 mEVs-Cy5 与 MCF-7 细胞共同孵育，通过流式细胞术（FCM）检测发现，随着孵育时间的延长，细胞的荧光强度在 8 小时达到峰值，随后略有下降，表明 mEVs 摄取存在饱和状态（图4b, c）。此外，研究发现细胞的荧光强度与 Cy5 标记密度呈严格的线性关系，这充分说明标记过程并未影响 mEVs 的细胞摄取能力（图4d）。进一步，通过 NanoFCM 对细胞培养基中 mEVs-Cy5 的浓度变化进行准确定量。结果显示，与 MCF-7 细胞共孵育后，mEVs-Cy5 的浓度显著降低，证实细胞成功摄取了 mEVs。经基于浓度变化的计算，每个 MCF-7 细胞平均摄取了约 2938 个 mEVs（图4h）。
通过抑制剂实验，研究者进一步分析了 mEVs 在细胞内的转运路径，并确定其进入细胞主要通过网格蛋白介导的内吞和巨胞饮作用。此外，通过共聚焦激光荧光显微镜观察，发现 mEVs 最初与溶酶体共定位，但 24 小时后部分 mEVs 成功从溶酶体中逃逸（图5a-g）。上述发现揭示了 mEVs 在细胞内的转运特征，为其在细胞质中释放药物提供了潜在的作用机制和理论依据。
04 药物递送和细胞毒性
为了评估 mEVs 作为药物递送载体的潜力，研究者将化疗药物紫杉醇（FITC标记，PTX-FITC）装载至 mEVs 中，并利用新方法实现双重标记（Cy5标记mEVs，FITC标记药物）。通过 NanoFCM 分析，发现约 90% 的 mEVs 成功装载了 PTX-FITC，进一步的共标记实验表明，装载了 PTX 药物的 mEVs 均标记上了 Cy5，双阳性比例高达 86.6%。相比之下，传统亲脂性染料 DiD 标记显著减弱了 mEVs 载药的能力（图6b-d）。综上结果表明，mEVs 具备高效装载药物的能力，且聚糖锚定标记不影响 mEVs 的载药能力。
进一步通过 FCM 实时跟踪细胞摄取过程，结果显示，细胞内 Cy5 荧光强度在 8 小时达到峰值，而 FITC 荧光强度在 24 小时后显著增加。此外，利用 FITC 的 pH 敏感荧光特性，研究者观察到其荧光信号的变化，证实了 mEVs 能够逃离溶酶体，并将携带的药物以“爆发式”方式释放至细胞质中（图6f-h）。癌细胞毒性实验也显示，mEVs-PTX-FITC 在作用 24 小时后显示出显著的细胞毒性（图6i），这一结果证明，mEVs 能够有效地将药物递送到细胞内，并发挥治疗效果。
总 结
本研究通过开发基于聚糖锚定的荧光标记技术，克服传统标记方法的局限性，实现了对 mEVs 的高效、稳定标记。此种标记方法不会损害 mEVs 的完整性或摄取行为，也不会诱导囊泡聚集或染料泄漏，其综合表现显著优于传统的膜染料。已有数据表明，基于聚糖锚定的荧光标记技术具有广泛的适用性，已在多种来源的 EVs 中成功实现。此外，本研究还评估了 mEVs 作为药物递送载体的潜力，装载了紫杉醇的 mEVs 在癌细胞内展现出显著的杀伤作用，有力证实了其作为药物递送载体的潜力。该技术不仅为 EVs 的细胞摄取和药物递送机制提供了重要理论依据，还为基于 EVs 的靶向药物递送进一步研究和应用铺平了道路。