细胞外囊泡 (EVs) 凭借其携带生物活性分子并精准传递至特定靶细胞的卓越能力，在诊断与治疗领域展现出极为广阔的应用前景。准确表征和定量EVs对于理解其功能和临床相关性至关重要。在EVs研究与转化应用过程中，荧光标记技术被广泛应用于EVs的表征。但固有的异质性以及缺乏通用的蛋白标记物等因素，使该方法面临诸多挑战。诸如一系列亟待解决的关键问题：如何判断自制EVs的质量是否符合标准？怎样客观评价EVs的纯度？是否存在通用型染料能够特异性识别EVs？在种类繁多的荧光染料中，如何筛选出性能最优的标记工具？

带着这些问题，NanoFCM英国团队联合Oxford Brookes大学以及Sheffield Hallam大学在Journal of extracellular biology发表一篇题为“Shining a light on fluorescent EV dyes: Evaluating efficacy, specificity and suitability by nano-flow cytometry”的研究论文。本研究通过纳米流式检测技术 (nFCM) 在单颗粒水平从EVs 的标记效率、特异性和通用性等多个维度综合评估了六种商品化的荧光染料。研究者旨在为EVs的荧光标记提供一种系统性的评估方法，并为选择合适的膜染料提供有价值的参考依据，从而推动EVs的基础研究和临床应用。

一、膜染料最佳浓度确认
研究者选取六种商品化膜染料（表1）。为了确定每种染料与EVs的最佳结合比例，研究者开展了一系列浓度优化实验，旨在实现对EVs的高效标记，同时最大程度地降低因染料过量而引发的背景荧光干扰。研究者将SW480细胞系来源的EVs稀释到2×1010particles/mL的浓度，分别与不同浓度梯度的膜染料进行孵育。凭借nFCM高灵敏检测性能以及其实时监测背景水平的能力，通过分析荧光阳性率和荧光背景水平来评估染料的性能。实验结果显示，每种染料均存在最佳标记浓度：在此浓度下，EVs的荧光阳性率能够达到峰值，同时荧光背景水平被有效控制在较低水平（图1D-G）。进一步分析原始数据，研究者观察到当膜染料的浓度过高时，荧光背景水平显著升高，从而掩盖了弱荧光信号，使得EVs的标记效果大打折扣（图1A）；相反，当膜染料的浓度适中时，EVs的标记效率显著提高，且荧光背景维持在较低水平。这种平衡使得检测到的荧光信号清晰可辨，能够有效区分信号和背景噪声，从而确保实验结果的准确性和可靠性（图1B）。然而，如果膜染料的浓度过低，许多EVs将无法被染色，导致标记效率低下，进而影响实验的整体效果（图1C）。

表1. 膜染料基本情况

图1. 通过nFCM优化膜染料浓度

二、膜染料标记效率对比
为了评估不同膜染料的标记效率和特异性，研究者选取了SW620和SW480两种细胞来源的EVs进行膜染料标记，并通过nFCM检测荧光阳性率。结果显示，CMDR、MemGlow 640和MemGlow 488在两种细胞来源EVs的标记效率均较高，阳性率超过95%；相较之下，ExoBrite 490/515 和ExoBrite 640/660在SW620来源EVs的标记效率较低，低于50%（图2a-g）。研究者进一步采用5% Triton X-100处理所有样本以验证标记特异性。结果显示，处理后，SW620来源EVs颗粒浓度降低了68.6%，而SW480来源EVs的颗粒浓度降低幅度更大，达到了73.4%（图2h）。这一结果不仅证实了染料标记的特异性，还揭示了不同细胞系来源的EVs在膜结构稳定性上可能存在差异。
 

图2. 六种膜染料标记SW620和SW480来源EVs的标记效率

为了进一步验证染料对EVs的标记效率和特异性，研究者将膜染料与抗四跨膜蛋白抗体 (CD9、CD63、CD81) 进行了共标记。通过分析四跨膜蛋白阳性颗粒中膜染料标记的百分比来评估染料的标记效率和特异性。结果显示，MemGlow 640、CMDR和MemGlow 488的标记效果最佳，荧光阳性率大于95%（图3a）。未能被染料标记的四跨膜蛋白阳性颗粒的粒径远小于被标记的颗粒（图3b-e），这可能是由于小粒径EVs表面靶标（如GM1 糖鞘脂或酯酶）表达量过低而影响了染料的标记效率。
 

图3. 不同膜染料与三种抗四跨膜蛋白抗体共标记

三、膜染料自团聚对比
膜染料的自团聚可能会导致染料形成与EVs大小相似的荧光颗粒，并在荧光检测中产生假阳性信号，从而影响实验的准确性和可靠性。为了评估自团聚现象，研究者将每种膜染料分别与无颗粒磷酸盐缓冲液 (PBS) 进行标记，以确定是否产生自团聚。结果显示，在最佳标记浓度下，所用膜染料缓冲液中形成的荧光阳性颗粒数量极低（图4a-g）。这表明所选荧光染料自团聚对EVs脂膜标记结果影响较小。
 

图4. 膜染料在PBS中自团聚情况

四、膜染料特异性对比
为了评估膜染料是否会特异性地标记其他脂质结构，研究者尝试用膜染料标记极低密度脂蛋白 (VLDLs)。结果显示，MemGlow 488和MemGlow 640对VLDLs的标记效率接近100%，而其他膜染料标记比例均低于15%（表2）。这表明MemGlow系列染料对VLDLs存在显著性结合。

为了进一步评估膜染料在复杂环境中的标记特异性，研究者利用血浆来源EVs进行测试。结果显示，CMDR、MemGlow 488和MemGlow 640呈现出较高的标记效率，而ExoBrite 640/660、CTDR和ExoBrite 490/515的标记比例均低于15%（表2）。

综上结果表明，MemGlow 488和MemGlow 640虽在血浆EVs中具备高效标记能力，但其对VLDLs的强非特异性亲和力会干扰复杂样品中EVs的准确检测，限制了它们的应用场景。而CMDR不仅能高效标记血浆EVs，同时对VLDLs的非特异性结合较低，更适合在复杂生物样本中使用。

表2. 膜染料标记VLDLs和血浆来源EVs阳性率

五、膜染料亮度对比
荧光强度是评估染料性能的关键指标之一，它直接关系到EVs在不同灵敏度仪器的检测效果。高亮度的染料不仅能够提升对微小细胞外囊泡的检测能力，还能在低灵敏度仪器上实现EVs的有效检出。这不仅拓宽了EVs的检测范围，还能提高检测效率和准确性。为了量化评估染料的亮度，研究者提出了染色指数 (stain index) 的概念。染色指数是荧光阳性群体与阴性群体的MFI差值与阴性群体荧光背景水平的两倍标准差的比值。染色指数越高，表明染料的亮度越高。结果显示，MemGlow 488的亮度最高，染色指数高达242.4（图5a）。相比之下，ExoBrite 490/515和ExoBrite 640/660的亮度较低，染色指数分别为12.5和10.0（图5b）。此外，nFCM原始信号脉冲图直观呈现了不同染料标记的EVs的荧光信号强度差异（图5c, d），进一步验证了上述量化分析结果，为染料选择提供了可视化依据。
 

图5. 不同膜染料的荧光亮度

总结
研究者从标记效率、特异性、亮度和自团聚四个方面系统性评估六种膜染料在EVs标记中的性能（表3）。结果显示，MemGlow 488和MemGlow 640在标记效率和亮度方面表现出色，但对VLDLs的高亲和力限制了它们在复杂生物样本中的应用。CMDR则在特异性和低背景荧光方面表现出色，适合在复杂生物样本中使用。此外，研究者提出了未来研究的方向，包括拓展染料筛选范围、优化标记方法、多平台验证以及选取更多样化的临床样本等。这些发现不仅为EVs研究中染料的合理选择提供了科学依据，也为改进EVs标记技术、评估/优化分离纯化流程、制定EVs质量控制标准提供了新思路，有望进一步推动EVs的临床应用。

表3. 膜染料性能对比