人巨细胞病毒（herpesvirus human cytomegalovirus, HCMV）是一种广泛传播的疱疹病毒，全球成人中血清阳性率超 60%，可导致免疫功能低下者发生严重疾病，甚至致命感染。然而，HCMV 致病机制研究长期受限于核心技术瓶颈：所有体外培养的病毒制剂中都存在宿主细胞分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），且病毒颗粒与 EVs 在物理和生化性质上高度相似。HCMV 感染还会劫持宿主 EV 生物合成通路，导致感染细胞分泌的 EVs 携带晚期结构域序列的病毒蛋白，进一步模糊两者边界。如果不将病毒颗粒与 EVs 和污染物分离，就无法研究其功能特性。

传统的分离手段通常是基于物理和生化性质差异，很难区分病毒和 EVs。如密度梯度离心会使病毒与 EVs 共迁移，且没有有效的手段检查污染物的存在；由于 EVs 和病毒的蛋白组成存在重叠，磁性捕获或亲和层析等方法并不总是具有选择性。另一方面，常规表征方法的缺陷会加剧纯化相关的挑战，导致对 EVs 或病毒制剂中污染水平的误判。ELISA、Western Blotting 和蛋白组学等方法展示的是所有颗粒混合物整体的集群平均结果；像电镜这样的单颗粒表征方法不易获取且通量很低；病毒空斑实验主要检测功能完整的病毒，无法检测非感染性病毒颗粒的污染。

近期，帝国理工团队在 Journal of Extracellular Vesicles 发表了题为“Nano-Flow Cytometry-Guided Discrimination and Separation of Human Cytomegalovirus Virions and Extracellular Vesicles”的突破性研究。本研究开发了一种基于纳米流式检测技术（NanoFCM）的核酸染色策略，首次实现了从 HCMV 感染细胞上清的混合物中将病毒颗粒和 EVs 精准区分和同步定量分析（图1），并据此开发高效的 HCMV 分离方法，为深入探究 EVs 及病毒相关的功能性研究开辟了新路径。

图1. NanoFCM 对 HCMV、DBs 与 EVs 的定性和定量分析

一、颗粒浓度和粒径检测
研究团队首先利用 NanoFCM 对细胞上清中的颗粒进行无标记浓度和粒径检测。该方法基于侧向散射信号和单颗粒检测策略建立：侧向散射强度与颗粒大小成正比，脉冲频率则反映颗粒浓度。NanoFCM 分析显示，与未感染细胞上清相比（图2A），HCMV 感染细胞上清具有更多且更强的侧向散射脉冲信号（图2B），提示 HCMV 感染不仅诱导细胞分泌颗粒显著增加，还产生更多大颗粒（图2C, E）。粒径分布图分析进一步揭示，未感染组产生的 EVs 粒径分布主要集中在 50 nm 左右（图2D）；而 HCMV 感染组，除了 50 nm 的 EVs 主峰外，颗粒粒径分布范围明显扩宽，并出现了约 140 nm 的额外峰值（图2E），该峰值代表 HCMV 病毒颗粒和密集体（dense bodies, DBs）的存在。

图2. 细胞上清中颗粒浓度和粒径检测

二、核酸染色对颗粒进行精准鉴别
为了精确区分 HCMV、DBs 和 EVs，研究团队采用核酸染料 SYTO 13、SYBR Green I 和 SYBR Safe 对 HCMV 感染细胞产生的颗粒进行染色，以实现分型和定量。NanoFCM 结果显示，未感染组（图3A）仅检测到 EVs 群体，而 HCMV 感染组（图3B）的二维散点图中可以清晰区分三个特征性群体，分别是高散射光且高荧光强度的 HCMV，低散射光和不同荧光强度的 EVs，高散射光但较低荧光的 DBs。三种染料所测参数结果一致性良好（图3C），其中 SYBR Green I 对病毒染色效果最佳，其荧光强度更高且背景荧光低，提供了更清晰的分群结果。此外，研究团队对两组细胞上清中的颗粒进行了透射电子显微镜（TEM）分析，直观证实了未感染组中只有 EVs（图3D），而 HCMV 感染组中则同时存在大量病毒颗粒、DBs 和 EVs（图3E），这与 NanoFCM 数据高度一致。综上所述，NanoFCM 可基于颗粒的荧光信号和侧向散射特征，精确区分 HCMV、DBs 和 EVs，并提供可靠的定量数据，为后续分离技术的建立奠定了关键基础。

图3. NanoFCM 结合核酸染色对 HCMV、DBs 和 EVs 的鉴别

三、病毒颗粒定量和感染动力学
为了阐明 HCMV 感染过程中病毒颗粒和 EVs 的动态变化，研究团队利用 NanoFCM 对病毒颗粒进行定量监测。如图 4 所示，病毒颗粒浓度随着时间推移显著增加。同时，NanoFCM 能够在不同感染复数（MOI）条件下准确量化这一变化过程，且其定量趋势与 qPCR 结果一致，验证了 NanoFCM 定量的可靠性。此外，分析不同时间点病毒颗粒的占比发现，尽管其绝对数量增加，但其占总颗粒数量的百分比始终低于 15%。这表明在 HCMV 感染细胞中，除了病毒颗粒之外，还有大量的非病毒颗粒（如 EVs）被分泌。

图4. NanoFCM 监测病毒感染动力学

四、NanoFCM 评估病毒与 EVs 的分离方法
为了实现 HCMV、DBs 和 EVs 的有效分离，研究团队基于它们的密度差异，优化了一种基于碘克沙醇垫高速离心的纯化方法。采用 SYBR Green I 染色结合 NanoFCM 对该分离纯化方法进行评估。高速离心后，NanoFCM 分析显示 HCMV 和 DBs 主要富集于离心管底部，而 EVs 则富集在上层液体中（图5）。TEM 表征进一步证实底部沉淀物中含有大量 HCMV 和 DBs，此外，空斑实验表明该分离过程对病毒的感染性无显著影响。综上结果表明，基于密度垫的高速离心法不仅能够高效分离 HCMV 和 EVs，还能保持病毒的感染性。

图5. 密度垫高速离心分离病毒与 EVs

为了进一步获得高纯度 EVs 样本，研究团队采用尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）去除上清中残留的 HCMV 和 DBs。TEM 成像显示（图6A, B），经 SEC 纯化后，未感染组和 HCMV 感染组的 EVs 形态无明显差异，且未观察到 HCMV 和 DBs 存在。NanoFCM 分析（图6C, D）进一步证实了纯化后的 EVs 样本几乎没有病毒颗粒污染，EVs 纯度可达 96%。此外，研究发现 HCMV 感染组 EVs 产量（3.53×1012）显著高于未感染组产量（1.43×1012），且两组分泌的 EVs 粒径分布存在差异。EVs 表面标志物 CD81 分析显示，未感染组 CD81 阳性 EVs 占比为 23%，而感染组则升高至 38.5%（图6E, F）。这些结果表明，HCMV 感染可能改变 EVs 的生发途径。

图6. 经 SEC 纯化后 EVs 的表征

总 结
本研究基于 NanoFCM 平台创新性地开发了一种核酸染色技术方案，首次在单颗粒水平实现了对 HCMV、DBs 与 EVs 的精准区分与同步定量分析。进一步结合碘克沙醇垫离心与 SEC 纯化，建立了一套高效的病毒（HCMV/DBs）与 EVs 分离流程。这些技术突破不仅为 HCMV 相关研究奠定了关键方法学基础，也为深入探索 EVs 生物学及病毒-EVs 相互作用提供了全新的技术平台。所构建的“鉴别-分离-验证”技术体系具有普适性，可拓展应用于其他病毒及纳米颗粒研究。该研究对于推动病毒学、细胞生物学和转化医学的交叉融合具有重要意义，并在病毒载体开发、EVs 的靶向递送以及临床感染的精准监测等多领域展现出广阔的科学价值和应用前景。

展 望
NanoFCM 凭借其极高的灵敏度，其散射通道能够检测低至 24 nm 二氧化硅颗粒，荧光通道则能实现单个核酸、单个抗体或单个藻红蛋白的定量分析。相较于传统的 qPCR 和 TEM 技术，NanoFCM 可在极短的时间内提供单颗粒水平的理化和生化定量信息，同时避免了传统流式细胞术的集群检测，从而显著提升研究效率和结果的精准度。结合核酸染色或免疫荧光标记策略，该技术能够精准区分并准确定量复杂混合物中的不同颗粒类型。此外，其纯度分析功能有效评估和优化分离纯化方案，提高目标产物的回收率及纯度。随着研究的深入，NanoFCM 有望在病毒学、纳米药物研发以及个性化医疗等领域发挥更为重要的作用。