眼-脑轴新突破：眼部3D成像应用于阿尔茨海默病Aβ检测
2025-06-03 来源:本站 点击次数:174近年来，随着对AD病理机制的深入研究，科学家们发现眼睛作为中枢神经系统的延伸，可能成为检测脑部AD病理变化的无创窗口。光片荧光显微镜（LSFM）结合组织透明化技术的出现，为研究眼与脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）的三维分布提供了有力工具。
研究背景与技术挑战
AD早期诊断的困境与眼部检测的潜力
随着对AD病理机制的深入研究，科学家们发现眼组织与脑组织在胚胎起源及结构功能上有密切联系，这使得眼睛有望成为检测脑部AD病理变化的无创窗口。眼部的视网膜、视神经等结构不仅在解剖上与大脑相连，而且在生理和病理过程中也具有相似性。然而，尽管眼部检测具有无创、便捷、成本低等优势，但如何准确量化眼部Aβ并建立其与脑部Aβ负担的相关性仍是一个亟待解决的问题。
二维成像技术在评估完整眼球中Aβ的三维空间分布方面存在明显局限。二维切片方法破坏了眼球的三维结构完整性，难以全面捕捉Aβ在整个眼球中的分布特征。此外，二维图像的分析往往依赖于对有限切片的观察和测量，容易导致数据的片面性和不准确性。
组织透明化与三维成像的技术难题
光片荧光显微镜（LSFM）结合组织透明化技术为解决上述问题提供了新的可能性，但在实际应用中也面临诸多技术难题。首先，如何优化透明化方案，确保眼球各部分组织的均匀透明化，同时避免组织结构的破坏和抗原性的丧失，是该技术面临的一个关键挑战。其次，三维成像需要高分辨率的显微镜系统和精确的图像重建算法。在对完整眼球和大脑进行成像时，如何在大样本范围内实现均匀的荧光激发和信号检测，以及如何处理和分析海量的三维图像数据，也是需要克服的技术障碍。此外，为了实现对Aβ的特异性标记，还需要选择合适的荧光探针或染色剂，并优化染色条件，以减少背景信号和非特异性结合，提高成像的灵敏度和特异性。
技术创新与应用
光片荧光显微镜结合组织透明化技术的原理与优势
光片荧光显微镜（LSFM）结合组织透明化技术是本研究的核心创新点之一。组织透明化技术通过化学方法去除样本中的脂质和部分蛋白质，使原本不透明的生物组织变得透明，从而允许光线深入穿透样本，为三维成像提供了基础。LSFM则利用薄薄的光片对样本进行逐层激发，仅照亮焦平面处的荧光分子，减少了非焦平面的荧光干扰，提高了成像的信噪比和分辨率。与传统的共聚焦显微镜相比，LSFM具有成像速度快、光漂白和光毒性低等优势，特别适合对大体积样本进行高分辨率三维成像。结合组织透明化技术，LSFM可以实现对完整眼球和大脑组织中Aβ的深度可视化，揭示其在三维空间中的分布特征和相互作用关系，为研究阿尔茨海默病的病理机制提供了前所未有的视角。
多重标记与成像方案的设计
为了全面评估阿尔茨海默病小鼠眼与脑中的Aβ负担以及相关的神经炎症反应，研究团队设计了一种多重标记与成像方案。具体来说，使用硫黄素S对Aβ进行特异性染色，这是一种常用的Aβ染色剂，能够与Aβ斑块中的β-叠结构特异性结合，发出荧光信号。同时，采用抗CD11b抗体标记小胶质细胞和抗ACSA-2抗体标记星形胶质细胞，以观察神经炎症细胞在Aβ沉积周围的反应情况。这种多重标记方案使得研究人员能够在同一张三维图像中同时观察到Aβ斑块、小胶质细胞和星形胶质细胞的分布和相互关系，为深入理解阿尔茨海默病的病理生理过程提供了丰富的信息。在成像参数设置方面，研究人员根据不同的荧光标记物选择了相应的激发波长（488nm、561nm和647nm），并优化了显微镜的光片厚度、步长和曝光时间等参数，以确保获得高质量的三维图像。
在数据分析方面，研究团队采用了Imaris软件生成感兴趣区域的三维表面模型，并结合自动阈值算法实现了对Aβ颗粒的准确分割和量化。自动阈值算法通过分析图像的灰度直方图，自动确定最佳阈值以区分目标信号和背景噪声，减少了人为因素对结果的影响。同时，为了进一步提高分割的准确性，研究人员还进行了手动修正，去除非细胞颗粒的误识别，如纤维状尘埃等。通过这种半自动化的分析流程，研究人员能够精确测量每个Aβ颗粒的体积、表面积等参数，并对整个眼球和大脑中的Aβ负担进行量化分析。此外，研究团队还开发了一种基于体积渲染的可视化方法，将复杂的三维数据转化为直观的图像，便于观察和比较不同样本之间的差异。这种方法不仅提高了数据分析的效率和准确性，还为研究结果的展示和解释提供了有力支持。
成像实验与结果分析
AD小鼠与对照组样本的收集与处理
研究人员选取了10只44周龄的5xFAD转基因AD小鼠和7只同龄的C57BL/6J野生型小鼠作为对照组。5xFAD小鼠是一种常用的阿尔茨海默病动物模型，其基因组中携带了五种家族性AD突变，能够模拟人类AD患者大脑中Aβ的过度产生和沉积。在实验过程中，小鼠先接受经颅灌注，随后取出眼球和大脑组织，并将其固定在4%碘酸盐溶液中。为了进行组织透明化处理，研究团队使用了亲水性Binaree组织透明化试剂盒，按照特定的步骤和条件对样本进行处理，包括初始透明化、洗涤和通透化等过程。尽管在透明化过程中有4个AD小鼠眼球因机械应力等因素受损，但最终成功处理了6个AD小鼠眼球、7个对照组眼球、10个AD大脑和7个对照组大脑样本，为后续的成像和分析提供了足够的样本量。
眼球和大脑中Aβ的三维分布特征
通过LSFM成像技术，研究人员观察到AD小鼠的眼球和大脑中均存在大量的Aβ斑块样特征，且其分布具有一定的规律性。在眼球中，Aβ的积累不仅局限于视网膜和视神经等后部结构，还在虹膜、角膜和晶状体等前部区域有显著分布。这表明Aβ在眼球中的沉积具有广泛的三维分布特征，可能影响眼部的多个功能区域。与对照组相比，AD小鼠眼球中的Aβ总斑块数量、总表面积和总表面体积均显著增加。在大脑中，AD小鼠同样表现出更高的摄取和更大的Aβ斑块样特征的总表面积和总表面体积。这些结果充分证明了AD小鼠眼与脑中Aβ负担的显著增加，为深入研究其相关性奠定了基础。
眼与脑Aβ负担的相关性分析
研究的一个关键发现是眼球和大脑中Aβ斑块样特征的总表面积和总表面体积之间存在强正相关。相关系数分析显示，眼球和大脑中Aβ总表面积的相关系数为0.722，总表面体积的相关系数为0.810，P值均小于0.01。这表明眼球中Aβ的三维分布与大脑中的Aβ负担具有高度的相关性，即眼球中Aβ的积累程度可以反映大脑中Aβ的病理状态。此外，单个斑块样特征的表面积和体积在眼球和大脑之间也表现出强相关性，相关系数分别为0.808和0.824，P值均小于0.01。这些结果进一步支持了眼与脑Aβ负担之间存在密切联系的观点，为开发基于眼部检测的AD早期诊断工具提供了科学依据。然而，值得注意的是，研究中并未发现眼与脑之间Aβ斑块样特征的形态参数（如椭球度和球形度）存在显著相关性，这可能表明Aβ在眼和脑中的聚集形态存在差异，其背后的生物学机制有待进一步探讨。
神经炎症反应的差异性观察
在对神经炎症反应的观察中，研究人员发现AD小鼠大脑中星形胶质细胞和小胶质细胞的表达显著增加，这与已知的AD病理特征一致，表明大脑中存在明显的神经炎症反应。然而，在AD小鼠的眼球中并未检测到这些神经炎症标志物的表达。这一结果可能有多种解释。一方面，可能是因为本研究中使用的44周龄AD小鼠处于疾病的早期阶段，眼部的神经炎症反应尚未充分发展，或者其表达水平较低而无法被当前的检测方法所捕捉。另一方面，也可能与实验中使用的抗体穿透能力有限有关，导致未能有效标记眼部的星形胶质细胞和小胶质细胞。此外，眼部的免疫环境与大脑有所不同，可能对神经炎症反应的激活和表现形式产生影响。这一发现提示我们在研究阿尔茨海默病的神经炎症机制时，需要充分考虑眼与脑之间的差异性，进一步探索眼部神经炎症反应的特点及其与脑部神经炎症的关系。
总结与展望
研究利用光片荧光显微镜结合组织透明化技术，首次实现了对完整眼球和大脑中Aβ负担的三维可视化和量化分析，并发现了眼与脑中Aβ负担的强相关性。这一发现不仅加深了我们对Aβ病理系统性本质的理解，而且为开发基于眼部Aβ检测的无创早期诊断工具提供了科学依据。然而，研究也存在局限性，如样本量较小、仅针对特定年龄段的小鼠模型等。未来的研究应扩大样本量，涵盖不同疾病阶段和遗传背景的模型，并进一步探索眼与脑Aβ相关性的分子机制和生物学意义。此外，还需要开发更特异的成像探针和更先进的成像技术，以提高检测的准确性和灵敏度。尽管如此，本研究的成果仍为阿尔茨海默病的早期诊断和治疗监测提供了新的视角和潜在的生物标志物，有望推动该领域向更精准、更无创的诊断方法发展。
论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Son HJ, Kim S, Kim SY, Jung JH, Lee SH, Kim SJ, Kim C, Hahn A. Three-Dimensional β-Amyloid Burden Correlation Between the Eye and Brain in Alzheimer's Disease Mice Using Light-Sheet Fluorescence Microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025 Mar 3;66(3):34.
DOI:10.1167/iovs.66.3.34.