Stretch-induced damage in endothelial monolayers

Keywords: Aging; Cell mechanics; Endothelium; Mechanobiology; Senescence; Stretch.

由于血流的脉动性，包括流体剪切力、压力和循环拉伸在内的几种血流动力学力在体内作用在内皮层。内皮细胞感知这些机械刺激，并通过机械转导机制调整其形态和功能，以维持内皮稳态和屏障完整性。循环拉伸拉伸影响几个关键的内皮细胞功能。生理拉伸（5-15%）维持血管稳态，而超生理水平（>20%）启动生化途径，可能导致疾病进展。

内皮细胞形成单细胞层，排列在血管和淋巴管的内表面。它们在血液或淋巴与周围组织之间形成屏障，控制分子的双向运输。内皮细胞对机械刺激的反应及其机械特性会随着细胞衰老（cell senescence）而变化，这是一种以增殖停滞为特征的细胞命运。单层中衰老细胞的存在与细胞间连接受损和高通透性有关。老化（aging）会引起细胞力学的变化，通过其结构组成（即细胞骨架、黏着斑、核力学）和化学机械途径（如 Hippo、RhoA）的表型变化来影响细胞对机械力的感觉和反应。

研究发现，通过对细胞进行快速和高拉伸，可以识别表型被动和主动机械反应的明显差异。在苏黎世联邦理工学院机械与工艺工程系、苏黎世大学再生医学研究所的进一步研究中，将内皮单层暴露在不同水平的快速单轴拉伸下，以确定它们的拉伸极限，并展示了它们的弹性和恢复能力如何受到老化和衰老的影响。研究成果发表于 Biomaterials Advances 期刊题为“Stretch-induced damage in endothelial monolayers”。
首先，为了评估非衰老与衰老和老化单层细胞对不同瞬时拉伸水平的反应，测试了三种不同的细胞群：HUVEC、TNF-α处理的 HUVEC 和单供体 > 50 岁的 HSaVVEC。在 TNF-α处理的 HUVEC（体外衰老模型）和 HSaVVEC 中检测到较高的 SA-β-gal 阳性细胞，表明这些细胞群存在基础水平的衰老。此外，还检测到反映衰老和老化表型的其他特征，如形状扩大、Claudin-5和 VE-cadherin在连接处的定位受损及整体下调、黏着斑复合物分子磷酸化Paxillin的上调。因此，研究中使用的三种不同的内皮细胞类型可能代表以下表型：1）HUVEC – 年轻/非衰老；2）HUVEC TNF-α – 衰老；3）HSaVVEC – 老化/衰老。

与相对未处理的对照相比，HUVEC TNF-α 中的局部细胞密度显著降低，与 HSaVVEC 单层相似（图1 A、B），进一步证实了衰老特性。通过 β-连环蛋白染色的 IF 图像分割，发现 HSaVVEC 中空隙区域更大（图1 B），表明单层完整性较低。HUVEC TNF-α细胞间连接处的 SEM 图像显示，丝状伪足跨越间隙伸展（图1 C），表明与对照相比，屏障被破坏。总之，每种表型的描述如下：年轻/非衰老——高密度，高单层完整性；衰老——低密度，中等单层完整性；老化/衰老——低密度，低单层完整性。

为了评估细胞对急性拉伸的即时和后续反应，将体外单轴双稳态装置用于拉伸内皮单层。图1 D-F 显示了 40% 单轴应变对年轻、衰老和老化/衰老细胞的瞬时和延迟效应的代表性图像。通过量化拉伸应用后的空隙面积来评估造成的损害，发现每种细胞类型都显示出明显的差异。

HUVEC 单层对拉伸的耐受最高。在 40-50% 应变下，瞬时空隙百分比面积绝对增加仅为 1.8%（图1 G）。它们形成许多小空隙（图1 D、G），这些空隙累积成一个小的瞬时空隙区域（图1 G）。在延迟条件下，即使在超生理应变值（>15%）下，HUVEC 也会扩散以覆盖任何最初受损的空隙区域并重组它们的细胞间连接，恢复完整的单层（图1 D、G、K）。

HUVEC TNF-α 单层可耐受生理水平的应变（即高达 10-20%）。在 20-30% 应变下，延迟空隙面积的绝对值显著增加 3.4%（图1 H）。在 10-20% 的生理范围内显示出单层完整性恢复潜力，瞬时和延迟条件之间的空隙数量大大减少，并且对照和延迟空隙百分比面积之间没有显著差异。在较大的应变下，相对于瞬时条件，延迟损伤增加，由于细胞分离而形成大空隙（图1 E、H、L）。

有趣的是，HSaVVEC 单层对拉伸最敏感（图1 C、F、I）。40–50% 的应变条件下，延迟空隙面积方面显示出最大的绝对增加（图1 F），即使在低应变（10-20%）下也显著增加（图1 J）。随着小空隙和大空隙的形成，空隙数量（空隙计数）立即增加，而与静态控制相比，延迟的空隙计数变化是微不足道的，因为大量细胞分离导致很少的大空隙（图1 J、M）。

为了进一步证明拉伸的超生理水平损害了细胞，对 HUVEC 和 HUVEC TNF-α 单层的瞬时样本进行了基于膜完整性的活/死细胞活力测定。应用 40% 单轴应变10分钟后，鉴定的 HUVEC 细胞中 0.1% 被标记为死亡，而 2.7% 的 HUVEC TNF-α 细胞被标记死亡。死细胞数量的增加表明，衰老单层细胞比年轻单层细胞对拉伸更敏感、脆弱，并表明拉伸诱导的损伤是 30 分钟延迟时间条件下观察到的细胞死亡和随之而来的脱离的原因。

图 1 静态培养（顶部-静态）和快速单轴拉伸（底部-拉伸）后内皮单层的表征。

为了表征内皮单层中形成的损伤，分析了拉伸细胞的高倍率 IF 和 SEM 图像。具体来说，在 40% 应变的 HUVEC 单层中，只检测到应变的细胞间连接之间存在细胞间空隙（图2 A、D、F）。相反，在 HUVEC TNF-α 和 HSaVVEC 的衰老单层中发现了细胞间和细胞内空隙的混合物（图2 B、C、E、G）。此外，对于 HUVEC TNF-α，与 HUVEC 对照相比，细胞间空隙更大，细胞间连接断裂明显更多（图2 E、G）。在衰老和老化的单层细胞中观察到大的细胞内空隙（图2 B、C）是完全跨壁的，并伴有似乎已经解离的细胞膜（图2 G）。因此，进行了活/死测定，结果表明在拉伸之前，HUVEC 对照和 HUVEC TNF-α 细胞都是活的。在拉伸的 HUVEC TNF-α 单层中，膜完整性受损。有趣的是，尽管在瞬时拉伸的衰老细胞群的 IF 图像中发现了细胞内空隙，但在相应的延迟样本中未发现它们，这表明这些空隙可能导致细胞快速死亡和脱离。

既往报道称，衰老影响内皮机械转导，影响细胞行为并导致心血管疾病的发展。因此，接下来探讨了在急性超生理水平拉伸的老化和衰老细胞所表现出的较高脆弱性是否也会在周期性施加的生理水平应变中检测到。利用双轴拉伸装置，在1 Hz频率下对单层细胞进行18 h的循环双轴拉伸，最高可达约15% 的双轴应变。与急性拉伸结果一致，HUVEC TNF-α 和 HSaVVEC 对生理周期拉伸也更敏感，这损害了单层完整性。与静态对照组相比，衰老组和老化组在应变 >10 % 时测得空隙面积显著增加，而年轻 HUVEC 单层完全耐受循环拉伸，这表明在所有水平的循环拉伸中单层膜都保持融合。

图2 单轴延伸的细胞间和细胞内空隙的免疫荧光（IF）和扫描电子显微镜（SEM）图像。

由于对非常快速拉伸的即时反应不是由生物过程介导的，假设纯机械计算模型可以提供相关见解，以合理化年轻和老化/衰老内皮细胞之间损伤形成的差异。利用内皮单层计算模型进行单轴拉伸模拟，对两个级别的伸长率进行了计算：20 % 和 40 %。

实验研究了细胞大小是否可以单独证明细胞损伤的差异，因为老化和衰老的内皮细胞被证明体积更大。由小细胞或大细胞组成的单层细胞内能量没有差异，而大细胞在 40% 应变下表现出略大的细胞间能量。然而，没有发现细胞内能量的差异，从而得出结论，仅细胞大小不能解释在老化/衰老细胞中观察到的细胞内空隙形成。此外，在单层中大细胞的细胞间连接处发现更高的能量密度，表明这些过渡区域可能承受更高的应力，因此更有可能形成细胞间空隙。

根据之前关于年轻、衰老、老化/衰老细胞之间细胞-基质粘附差异的发现，假设细胞-基质粘附增加会导致更多的仿射变形，从而导致更高的细胞内应力，在衰老细胞中引起相应的细胞内空隙。文献支持随着衰老而增加黏着斑密度和细胞-基质粘附力的趋势，并且显示黏着斑大小显著增加。因此，为了匹配老化和衰老内皮细胞的表型特征，研究了改变黏着斑密度（图3 A、B）和大小对计算的细胞内和细胞间变形能量分量的综合影响。

增加黏着斑密度和大小导致更高的细胞内能量密度（应力纤维，图3 C），而细胞间连接的细胞间能量降低（图3 D）。这支持了老化和衰老表型中更高的损伤易感性和细胞内损伤的存在。对于可能发生较少仿射变形的年轻表型，细胞间连接处的应力更高，这可能支持对细胞间瞬时损伤的更高敏感性。较高的粘附性导致较低的细胞间变形能量，而 TNF-α处理的 HUVEC 中的相应空隙比 HUVEC 大。这与以前的发现一致，即衰老细胞的连接通常不如年轻细胞稳定。

根据计算结果，假设减少老化/衰老细胞的仿射变形会减少细胞内空隙的形成。为此，用 β1-整合素阻断抗体处理 HUVEC-TNF α内皮单层。阻断抗体的处理显示蛋白质印迹中磷酸化黏着斑激酶（p-FAK）和桩蛋白减少（图3 E、F），表明已建立的黏着斑。此外，黏着斑密度降低（图3 G、H）。然后，将这些细胞与对照组一起进行快速单轴拉伸，阻断 β1-整合素可阻止细胞内空隙的形成（图3 I），并将空隙形成转移到更大的细胞间空隙。此外，与 40% 应变情况下的对照组相比，从瞬时到延迟情况下空隙百分比面积的倍数变化往往较低（图3 J）。因此，证实了实验的假设，衰老细胞中黏着斑的减少不仅防止了在高应变下可瞬间检测到的细胞内空隙，还减少了瞬时拉伸后延迟空隙区域的形成。这表明黏着斑的减少可以减少细胞内损伤和与之相关的即将发生的脱离。

图3 模拟单轴拉伸实验的内皮细胞单层计算模型，同时在年轻（小和低黏着斑密度）衰老（大和高黏着斑密度）之间改变细胞表型。

总之，该研究确定了内皮变形与细胞损伤之间的定量关系。衰老和老化降低了内皮细胞的拉伸弹性，并影响了单层细胞的损伤方式。对于衰老和老化的内皮细胞表型，研究表明，超生理水平的急性拉伸可诱导可能致命的大细胞内破裂。对于年轻的表型，存在较大的超生理变形的细胞间空隙，但这种瞬时损伤可以在短时间内愈合。根据计算建模结果，衰老或老化内皮细胞的脆弱性可归因于与细胞-基质粘附增加相关的更多仿射变形。这些观察结果可能与未来的临床应用相关，如血管成形术的支架置入术和控制药物输送系统。

参考文献：Choi Y, Jakob R, Ehret AE, von Bohemer L, Cesarovic N, Falk V, Emmert MY, Mazza E, Giampietro C. Stretch-induced damage in endothelial monolayers. Biomater Adv. 2024 Oct;163:213938. doi: 10.1016/j.bioadv.2024.213938. Epub 2024 Jun 28. PMID: 38959650.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38959650/

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