高通量筛选平台助肽—人类白细胞抗原pHLA靶向药物安全评估
2025-06-13 来源:本站 点击次数:97高通量筛选平台 ValidaTe 助力肽 - 人类白细胞抗原pHLA靶向药物安全评估
--德国M2 点样仪实现微腔芯片的高精准加样
--德国M2 点样仪实现微腔芯片的高精准加样
T 细胞受体（T-cell receptor, TCR）疗法、双特异性 T 细胞衔接器（bispecific T-cell engagers, BiTE）等基于肽 - 人类白细胞抗原（peptide-human leukocyte antigen, pHLA）的免疫治疗手段，已逐步在癌症领域展现出巨大潜力，精准评估药物与 pHLA 的结合特异性成为临床前安全评估的关键。然而，仅HLA-I类分子的免疫肽组约至少15 万种 pHLA 复合物，传统技术如生物层干涉术（biolayer interferometry, BLI）、微阵列芯片SPR等，单次仅能最多检测96种相互作用，通量低、耗时久，极大的脱靶风险。因此，开发超高通量的筛选方法，对于确保 pHLA 靶向治疗药物的安全性和有效性，具有重要的临床意义。
2023 年 3 月，BioCopy 公司联合 Immatics Biotechnologies公司在《Scientific Reports》发表题为《An ultra-high-throughput screen for the evaluation of peptide HLA-Binder interactions》的文章。在该研究中，构建了一种高通量筛选平台ValidaTe，通过稳定化 pHLA 分子、聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxan, PDMS）微腔芯片与单色反射干涉技术（highSCORE）的结合，实现对 TCR 与超 500 种 pHLA 复合物相互作用的大规模筛选分析。
实验方法如下：
实验方法如下：
1.肽库制备与微腔芯片预处理
- 肽合成：制备 127 种多肽（含野生型及单氨基酸突变体），经高效液相色谱HPLC纯化后溶于二甲基亚砜（DMSO）/ 水（5%/95%），浓度 200 μg/ml。
- 微腔芯片（聚二甲基硅氧烷，PDMS 材质）：使用M2-Automation 非接触式皮升级／纳升级点样仪iOne，将 300 pl 肽溶液精准点样至 5k-PDMS 芯片的 5226 个微腔中（单个微腔体积 500 pL，直径 150 μm，间距 50 μm）。（图1）
- 干燥与存储：室温干燥后，芯片于 4℃保存，稳定期可达数月。
2.pHLA 复合物和肽-pHLA微腔芯片
- pHLA 纯化制备：表达含二硫键稳定化修饰的人类白细胞抗原 A02:01（human leukocyte antigen A02:01, HLA-A*02:01）重链与 β2 微球蛋白（β2-microglobulin, β2m），体外复性后经生物素化修饰（BirA 酶标记），终浓度 200 μg/ml。
- 肽-pHLA-微腔芯片：通过M2-Automation 非接触式皮升级／纳升级点样仪iOne，向含肽微腔中点样 900 pl HLA 溶液。孵育后，pHLA 复合物通过生物素 - 链霉亲和素（streptavidin, SA）相互作用，转移至预活化的 3D 链霉亲和素修饰玻璃片（highSCORE 芯片）。（图1）
图1肽-pHLA微腔芯片的实验流程图
（1）不同的多肽被点样至微腔芯片的独立微腔中，（2）多肽溶液干燥，（3）阵列可长期储存（4）将生物素化的 HLA 分子点样至各个微腔中发生复合物形成反应，（5）复合物通过生物素 - 链霉亲和素相互作用转移至链霉亲和素（SA）修饰的基底上，（6）用于不同分析物的无标记分析，（7）结合曲线中确定动力学参数。
（1）不同的多肽被点样至微腔芯片的独立微腔中，（2）多肽溶液干燥，（3）阵列可长期储存（4）将生物素化的 HLA 分子点样至各个微腔中发生复合物形成反应，（5）复合物通过生物素 - 链霉亲和素相互作用转移至链霉亲和素（SA）修饰的基底上，（6）用于不同分析物的无标记分析，（7）结合曲线中确定动力学参数。
3.超高通量结合动力学检测
- 分析物制备：可溶性高亲和力 TCR 分子梯度稀释至 16-480 nM。
- highSCORE 检测：将肽-pHLA 微腔芯片置于高通量反射干涉仪中，依次进行基线校正（180 s）、结合（250-500 s）、解离（300-600 s）检测，流速 2 μL/s，单次运行生成 5226 条结合曲线。
- 数据拟合：采用 1:1 结合模型拟合动力学参数（结合速率常数kass、解离速率常数kdiss、平衡解离常数KD），6 次重复实验累计获得超 3 万条有效曲线。
4.与传统技术的对比验证
- BLI 对照实验：使用 Octet RED384 系统，检测相同 pHLA-TCR 相互作用，对比发现 ValidaTe 平台数据集通量提升650 倍，且KD值相关性良好（R2>0.85），验证了新技术的准确性。(图2)
图2 a） 从 highSCORE 和 BLI 测量获得的KD值之间的相关性；BLI WTKD值显示为蓝色虚线，highSCORE WTKD表示为绿色虚线，箭头突出显示突出的点，灰色的点被排除在线性拟合之外。（b） highSCORE（绿色）和 BLI（蓝色）测量的log10(KD)值的直方图；BLI WTKD值显示为蓝色虚线，highSCORE WTKD表示为绿色虚线。
研究结论:
1.技术突破：ValidaTe 平台通过微腔芯片与自动化点样技术（M2-Automation 非接触式皮升级／纳升级点样仪iOne），解决了传统微阵列中 pHLA 复合物稳定性差、材料消耗高的难题，单次实验可处理超 500 种不同 pHLA 复合物，未来优化后有望突破 1000 种。
2.效率革命：相较于 BLI 的单次 96 通量得到的数据集，ValidaTe 实现650 倍提升，结合曲线生成速度从小时级缩短至分钟级，大幅降低时间与材料成本（单 spot 材料消耗仅为传统方法的 1/1000）。
3.应用价值：成功解析 TCR 与 pHLA 的结合特异性，定位关键氨基酸位点，为药物设计提供精准靶点，推动临床前脱靶风险评估进入 “全谱筛查” 时代。
技术前景与展望
该平台已实现商业化服务（BioCopy），可定制化筛选多种 HLA 亚型及治疗性分子（如 TCR 抗体、BiTE），适用于制药企业、科研机构的早期药物开发。未来计划拓展至细胞水平检测与复合物稳定性分析，助力更多创新型免疫疗法安全落地。
更多信息请参考原文：https://www.nature.com/articles/s41598-023-32384-z
M2-automation位于德国，专注于提供纳升-皮升级超微量点样生物芯片应用领域的解决方案及服务。自公司成立即以来，20年始终致力于开发高精度高灵活性生物样品喷点液体处理平台，
M2系列产品采用接触式/非接触式点样技术，可轻松实现包括但不限于纳米柱、微阵列、微针等各种标准化和个性化生物芯片制备，广泛应用于微流控、生物传感器、临床快检（POCT）等领域。
环亚生物，生命科学产品全国性代理商，具备完善的公司运营、产品管理、营销、售前技术支持和售后维修体系。环亚生物作为M2-automation大中华区代理商，负责相关产品大中华区的营销和售后支持。
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环亚生物科技有限公司
地址：上海市松江区莘砖公路518号9幢502室
电话：021-54583565
邮箱：info@apgbio.com
网址：www.apgbio.com
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2.效率革命：相较于 BLI 的单次 96 通量得到的数据集，ValidaTe 实现650 倍提升，结合曲线生成速度从小时级缩短至分钟级，大幅降低时间与材料成本（单 spot 材料消耗仅为传统方法的 1/1000）。
3.应用价值：成功解析 TCR 与 pHLA 的结合特异性，定位关键氨基酸位点，为药物设计提供精准靶点，推动临床前脱靶风险评估进入 “全谱筛查” 时代。
技术前景与展望
该平台已实现商业化服务（BioCopy），可定制化筛选多种 HLA 亚型及治疗性分子（如 TCR 抗体、BiTE），适用于制药企业、科研机构的早期药物开发。未来计划拓展至细胞水平检测与复合物稳定性分析，助力更多创新型免疫疗法安全落地。
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