Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss

Keywords: Piezo1; age-associated bone loss; endocortical bone resorption; mechanical stimulation.

衰老会导致松质骨和皮质间隔的骨质流失。随着年龄的增长，松质骨骨质丢失与骨形成减少和骨重塑率低有关。相比之下，与衰老相关的皮质骨骨质丢失主要是由于皮质内表面破骨细胞数量和骨吸收的增加。在皮质骨中，编码RANKL（一种对破骨细胞形成至关重要的细胞因子）的肿瘤坏死因子配体超家族成员11（Tnfsf11）随着年龄的增长而增加，RANKL的诱饵受体骨保护素（OPG）随着年龄的增长而减少，证明了破骨细胞形成增加在年龄相关的皮质骨丢失中的重要性。

机械刺激，如来自身体活动的刺激，通过增加成骨细胞的数量和活性来促进骨骼形成。相反，机械刺激的缺失通过促进破骨细胞形成和骨吸收导致骨质流失。因此，成骨细胞和破骨细胞都受到机械刺激的调控。此外，骨骼对机械负荷的合成代谢反应随着年龄的增长而减弱，表明老骨头感知和/或转导机械刺激的能力降低。这表明，机械刺激的减少会导致与年龄相关的骨质流失。

Piezo1 是一种机械敏感离子通道，能够感应各种机械刺激，包括膜拉伸、基质刚度和流体剪切应力，并在许多器官的机械转导中起重要作用。删除成骨细胞系细胞中的 Piezo1 基因，证明了 Piezo1 在骨稳态中起关键作用。

基于此，美国阿肯色大学医学院骨科及肌肉骨骼疾病研究中心团队探讨了 Piezo1 在成骨细胞谱系细胞中的表达是否在与年龄相关的骨质流失中起重要作用，发现随着年龄的增长，成骨细胞系细胞中 Piezo1 缺失的小鼠比对照小鼠失去更多的皮质骨，这与皮质内表面破骨细胞数量的增加显著相关。研究结果表明，Dmp1-Cre 靶细胞中的 Piezo1 表达对骨稳态至关重要，并介导骨骼对机械刺激的反应。研究成果发表于 Aging Cell 期刊题为“Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss”。

首先，为了确定 Piezo1 表达是否随着年龄的增长而变化，比较了不同小鼠品系 6 月龄和 24 月龄小鼠胫骨皮质骨中的 Piezo1 表达，均发现其在 24 月龄小鼠皮质骨中的表达显著降低。除小鼠外，还比较了年轻人和老年人受试者股骨颈皮质骨中 Piezo1 的表达，结果显示，与年轻人相比，老年人的 Piezo1 表达也有类似的降低。为了进一步验证这些发现，对小鼠和人类骨骼样本进行了 RNAscope，发现老龄鼠股骨和老年人类股骨颈皮质骨中的 Piezo1 mRNA 降低，与基因表达分析一致。这证明，衰老与骨骼中 Piezo1 表达降低之间存在相关性，Piezo1 表达的降低可能在与年龄相关的骨骼变化中发挥作用。

为了确定成骨细胞系细胞中 Piezo1 的表达是否在与年龄相关的骨质流失中发挥作用，构建 Dmp1-Cre 转基因靶细胞 Piezo1 条件性敲除小鼠（Dmp1‐Cre; Piezo1f/f）。正如预期，与 6 月龄小鼠相比，对照小鼠在 24 月龄时表现出与年龄相关的松质骨丢失，相比之下，条件性敲除小鼠在年轻时松质骨骨量低于对照组，但不会随着年龄的增长而进一步丢失（图1 a）。股骨皮质骨分析显示，对照小鼠在 24 月龄时比 6 月龄的皮质厚度更低（图1 b）。有趣的是，老龄条件性敲除小鼠与对照小鼠相比，皮质厚度随着年龄的增长而下降更严重（图1 b）。与此一致，24 月龄的条件性敲除小鼠表现出自发性胫骨骨折，而在年轻小鼠或老龄对照组中均未观察到骨折（图1 c）。这些结果表明，即使从较低的皮质厚度开始，成骨细胞和骨细胞中缺失 Piezo1 的小鼠也会随着年龄的增长而失去更多的皮质骨。

为了确定皮质骨丢失的部位，测量了股骨中轴的骨膜和骨内膜周长。显微 CT 分析显示，对照小鼠的骨膜周长随着年龄的增长而增加，成年条件性敲除小鼠与对照小鼠相比，小鼠的骨膜周长随年龄的增长表现出明显的增加（图1 d）。在对照组和条件性敲除组中，骨内膜周长均增加，但条件性敲除小鼠的这种增加大于对照小鼠（图1 e）。一致地，条件性敲除小鼠在股骨中轴测量的极惯性矩随年龄的增加被减弱（图1 f），且比对照小鼠产生更多的皮质孔隙（图1 g、h）。这些结果表明，Dmp1-Cre 靶向细胞中的 Piezo1 缺失增加了老龄小鼠的皮质内扩张和皮质骨孔隙率，说明条件性敲除小鼠皮质骨随着年龄的增长而丢失更多是由于皮层内骨吸收的增加。

图1 随着年龄的增长，成骨细胞和骨细胞中 Piezo1 的缺失加剧了皮质骨骨质流失。

接下来，为了了解骨骼表型的细胞基础，测量了股骨皮质内表面的破骨细胞数量和表面。TRAP 染色显示，在两种基因型中，老龄小鼠的骨细胞数量和骨内膜表面都比年轻小鼠增多，且在条件性敲除小鼠中显著升高（图2 a、b）。为了确定骨细胞中 Piezo1 的缺失是否增强其支持破骨细胞形成的能力，敲低 MLO-Y4 细胞（一种骨细胞样细胞系）中的 Piezo1，并在 M-CSF 存在下将这些细胞与骨髓衍生的巨噬细胞共培养。TRAP 染色显示，与对照细胞相比，Piezo1 敲低细胞具有更强的支持破骨细胞形成的能力（图2 c）。与染色一致，基因表达分析显示 Piezo1 敲低培养物中破骨细胞标志基因增加，包括 CtsK 和 Acp5（图2 d）。相比之下，使用Yoda1 激活 Piezo1 会抑制骨细胞支持破骨细胞形成的能力，表现为共培养 7 天后 Acp5 表达降低（图2 e）。此外，在体外培养股骨皮质骨，并用 Yoda1 处理骨样本 3 天，发现 Yoda1 在股骨皮质骨离体器官培养中降低了 Acp5 的表达（图2 f）。这些结果表明，成骨细胞和骨细胞中Piezo1 的缺失会促进皮质内表面破骨细胞的形成。

为了进一步了解 Piezo1 调节破骨细胞形成的机制，分析了已知在破骨细胞生成中起关键作用的基因的表达水平，包括 Piezo1 敲低 MLO-Y4 细胞中的 Tnfsf11 和 Tnfrsf11b。结果显示，Tnfrsf11b 在 Piezo1 敲低细胞中的表达显著降低，Yoda1 激活 Piezo1 导致 Tnfrsf11b 表达显著增加。同时，对小鼠左胫骨施加 5500 N 轴向压缩载荷（4Hz）促进了小鼠皮质骨中 Piezo1 的表达和 Tnfrsf11b 的表达。这些数据表明，Piezo1 通过刺激骨细胞中的 Tnfrsf11b 表达来控制破骨细胞的形成。

此外，Tnfrsf11b 表达随着年龄的增长而降低，类似于老龄小鼠中的 Piezo1 表达。重要的是，与年轻小鼠相比，Yoda1 诱导的 Tnfrsf11b 的增加在老龄小鼠分离的骨细胞中显著减弱。因此，Piezo1 的缺失可能会进一步降低老龄小鼠 Tnfrsf11b 的表达。为了确定 Piezo1 敲除小鼠中 Tnfrsf11b 的表达，进行 RNAscope 测量皮质骨中 Tnfrsf11b 的表达，发现在基因敲除小鼠中表达 Tnfrsf11b 的骨细胞百分比显著下降。这些结果表明，Piezo1 通过上调 Tnfrsf11b 表达来控制破骨细胞的形成。

图2 成骨细胞和骨细胞中 Piezo1 的缺失增加了皮质内表面破骨细胞的形成。

最后，为了研究 Piezo1 调节 Tnfrsf11b 表达的机制，使用 MLO-Y4 细胞模型检查了 Yoda1 诱导的 Tnfrsf11b 表达是否需要钙内流，因为 Piezo1 是一个钙允许离子通道，而 Yoda1 在 MLO-Y4 细胞中诱导钙内流。在无钙培养基中培养 MLO-Y4 细胞，并用 Yoda1 处理，发现 Yoda1 诱导的 Tnfrsf11b 表达在细胞外钙不存在的情况下完全减弱（图3 a）。用细胞内钙螯合剂 BAPTA 处理 MLO-Y4 细胞，发现 Yoda1 诱导的 Tnfrsf11b 表达在没有游离细胞内钙的情况下被阻断（图3 b）。

然后，研究了钙调蛋白（CaM）（一种介导细胞内钙信号传导的钙结合蛋白）对 Yoda1 诱导的 Tnfrsf11b 表达增加的影响。在氯化卡咪唑铵（CMZ，一种膜渗透性 CaM 拮抗剂）存在下用 Yoda1 处理细胞，发现CMZ 抑制了 Tnfrsf11b 表达的增加（图3 c）。因此，Ca2+ 和 CaM 是响应 Piezo1 激活而增加 Tnfrsf11b 表达所必需的。

Ca2+/CaM 已被证明可调节各种信号通路，包括 p38/MAPK、MEK/ERK、eNOS 和 mTOR 信号。此外，Piezo1 已被证明可调节内皮细胞中的 p38、eNOS 和 mTOR 信号。因此，利用这些通路的抑制剂来确定它们是否是 Piezo1 诱导的 Tnfrsf11b 表达所必需的。结果显示，mTOR 抑制剂 PP242 阻断了 Yoda1 诱导的 Tnfrsf11b 表达（图3 d）。其他通路抑制剂包括 SB203590（p38/MAPK 抑制剂）、PD98059（MEK/ERK 抑制剂）和 L-NAME（eNOS 抑制剂）不影响 Piezo1 激活诱导的 Tnfrsf11b 表达的增加 （图3 e）。这些结果表明，Piezo1 通过 Ca2+/CaM/mTOR 信号通路控制 Tnfrsf11b 的表达（图3 f）。

图3 Piezo1通过Ca2+/CaM/mTOR信号通路控制Tnfrsf11b的表达。

图4 图形概要

总之，该研究结果表明，机械负荷主要促进幼龄生长小鼠皮质骨的骨形成，导致骨量和骨大小增加。然而，在老龄小鼠中，机械负荷主要抑制骨吸收并防止皮质变薄和多孔隙。与此一致的是，随着小鼠年龄的增长，Piezo1 的作用从促进骨形成转变为抑制骨吸收。这些发现揭示了与年龄相关的骨质流失的复杂机制，并强调了机械刺激在衰老过程中保持骨骼完整性的重要性，为预防与衰老相关的骨骼疾病的治疗策略提供借鉴。

参考文献：Li X, Zhang C, Bowman HH, Stambough JB, Stronach BM, Mears SC, Barnes LC, Ambrogini E, Xiong J. Piezo1 opposes age-associated cortical bone loss. Aging Cell. 2023 Jun;22(6):e13846. doi: 10.1111/acel.13846. Epub 2023 May 5. PMID: 37147884; PMCID: PMC10265162.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37147884/

Journal Impact Factor (Clarivate):8

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