Bryostatin-1 improves function in arteries with suppressed endothelial cell autophagy

Keywords: Aging; Bryostatin-1; Endothelial cell; Nitric oxide.

内皮功能障碍是心血管衰老的标志，内皮细胞（EC）自噬的下降越来越被认为是导致血管病变的关键因素。以往研究揭示了抑制的 EC 自噬会破坏 EC 代谢，从而减弱 EC 功能。例如，遗传或药理学自噬受损后的牛（BAECs）和人（HAECs）的动脉 EC，以及 EC 自噬受损的老龄小鼠的原代动脉 EC，表现出剪切应力诱导的糖酵解通量和 ATP 产生下降。这种表型的后果包括通过蛋白激酶Cδ（PKCδ）向内皮一氧化氮（NO）合酶（eNOS）传递的 ATP/ADP 介导的嘌呤能 2Y1 受体（P2Y1R）信号减少，导致 NO 生成减少。随后，在具有遗传、药理学和年龄相关性 EC 自噬损伤的小鼠动脉中证明了这一发现的功能相关性。通过体外基因功能获得和丧失方法，进一步发现 p-PKCδ^T505 作为 P2Y1R 激活和 NO 生成之间的信号转导链接。这些研究结果可得出结论，在与抑制 EC 自噬相关的环境中靶向嘌呤能信号（如衰老）可能是治疗并发内皮功能障碍的选择。

基于此，美国犹他大学营养与综合生理学系、加州大学大卫格芬医学院心脏病学部及亚利桑那大学生理学系团队研究的重点是确定在与 EC 自噬受损相关的环境中寻找该通路中的另一个节点是否可能产生功能益处。研究人员试图通过验证以下假设来识别上述体外研究结果的翻译相关性：即恢复 PKCδ 信号可改善腔内血流介导的血管舒张，否则在遗传和生理性 EC 自噬受损的啮齿动物模型中会受到影响。研究成果发表于 GeroScience 期刊题为“Bryostatin-1 improves function in arteries with suppressed endothelial cell autophagy”。



早期研究发现，生理相关的剪切应力会增加糖酵解 ATP 的产生，导致在转染加扰而非 Atg3 siRNA 的 BAECs 中通过 PKCδ^T505 激活 P2Y1R 介导的 p-eNOS^S1177。支持 PKC 在将自噬依赖性嘌呤能介导的信号传递给 BAECs 中的 eNOS 中起核心作用，其他实验结果表明，剪切诱导的 p-eNOS^S1177 通过药理学（例如苔藓抑素-1）或遗传（例如 CA-PKCδ）激活 PKCδ^T505 在自噬受损的 BAECs 中恢复。因此，研究人员试图通过检验苔藓抑素-1 恢复剪切应力诱导的 p-eNOS^S1177 的假设来证实 HAECs 中的主要发现。

Atg3 介导 Atg8/LC3I 的脂质化形成成熟的 LC3（微管相关蛋白轻链3）-II，是形成成熟自噬体所必需的。接头蛋白p62（A170/sequestosome-1）连接/运送自噬体内受损/失调的细胞器，并在与溶酶体融合后降解。用 PBS 或 50 nM苔藓抑素-1 处理的HAECs暴露于0-20 dyne/cm2剪切应力下45分钟。正如预测，在转染非靶向但未转染 Atg3 sgRNA 的 HAECs 中，剪切应力增加了 LC3-II：GAPDH 积累、p62 降解和 p-eNOS^S1177：eNOS 活化（图1 A、C-E）。重要的是，转染 Atg3 sgRNA 的 HAECs 用苔藓抑素-1 处理，剪切应力诱导的 p-eNOS^S1177：eNOS 不影响 LC3-II：GAPDH 或 p62：GAPDH 比值（图1 B、F-H）。苔藓抑素-1 处理不影响细胞死亡或细胞凋亡。这表明，苔藓抑素-1 在 Atg3 敲低后恢复 HAECs 中的 p-eNOS^S1177。

图1 剪切应力诱导的 HAECs 中 p-eNOSS1177 可被 Atg3 敲低抑制，但可被苔藓抑素-1 恢复。

体外发现，苔藓抑素-1 在遗传性 EC 自噬受损的情况下恢复了剪切诱导的 p-eNOS^S1177，这激发了研究人员使用他莫昔芬诱导的 Atg3 耗竭的成年小鼠的股动脉和脑动脉研究离体功能相关性，特别是在 ECs 中。与 WT 小鼠相比，Atg3^EC-/- 的股动脉腔内血流介导的血管舒张功能减弱，用苔藓抑素-1 处理股动脉恢复了 Atg3^EC-/- 小鼠血管腔内血流介导的血管舒张，表明在这种情况下，NO 对血管舒张有重要贡献，苔藓抑素-1 诱发的 Atg3^EC-/- 小鼠股动脉的改善被L-NMMA（总NOS抑制剂）共孵育阻止。关于脑动脉，苔藓抑素-1 改善了乙酰胆碱诱发的血管舒张，而这种舒张在Atg3^EC-/- 小鼠的前动脉（ACA）和中动脉（MCA）中会受到抑制。这些结果强烈表明，苔藓抑素-1 在遗传性 EC 自噬受损的情况下重新激活 p-eNOS^S1177，在一定程度上改善了动脉功能。

进一步构建生理性 EC 自噬抑制模型，即衰老模型。与 7 个月龄的 C57BL/6 小鼠相比，24 月龄小鼠的原代动脉 ECs 的基础自噬以及剪切诱导的自噬通量、糖酵解、ATP 产生、p-eNOS^S1177 和 NO 的产生较低。与成年小鼠相比，老年小鼠股动脉中腔内血流介导的血管舒张受损，这种损害在L-NMMA同时治疗的成年小鼠的动脉中也得到了再现。值得注意的是，苔藓抑素-1 以 L-NMMA 敏感的方式使老年小鼠动脉中血流介导的血管舒张正常化（图2 A）。内皮独立功能（图2 B）以及非受体和受体介导的血管收缩在成年小鼠和老年小鼠之间相似。关于脑动脉，苔藓抑素-1 改善了乙酰胆碱诱发的血管舒张，而这种舒张在 老年小鼠与成年小鼠 MCA （图2 C）和 ACA （图2 E）中会受到抑制。这证实早期的发现，即两组MCAs （图2 D）和 ACAs（图2 F）中的血管平滑肌功能相似。这些数据表明，苔藓抑素-1 改善老龄小鼠的动脉功能。

图2 老年小鼠与成年小鼠的股动脉和脑动脉中的内皮依赖性血管舒张受损，但可通过苔藓抑素-1 恢复。

目前为止，研究观察到苔藓抑素-1 恢复了剪切诱导的 p-eNOS^S1177，否则会被 EC 自噬受损阻止，并且这一发现具有功能相关性，因为苔藓抑素-1 改善了遗传和生理性EC自噬受损模型中的内皮功能。基于上述发现，研究假设苔藓抑素-1 通过激活 p-PKCδ^T505 刺激 ECs 中的 p-eNOS^S1177。结果观察到，苔藓抑素-1 提高了 p-PKCδ^T505 及其下游靶标 p-PKD^S744/S748、p-PKD^S916 和 p-eNOS^S1177，这可以通过使用 10 μM Rottlerin 抑制 p-PKCδ^T505 来消除（Rottlerin是有报道的PKCδ抑制剂）。这表明，苔藓抑素-1 介导的 p-eNOS^S1177 激活对 PKC 抑制敏感。

由于观察到苔藓抑素-1 诱导的 PKD 激活明显比 PKCδ^T505 上调更稳健（图3 A-D），并且 Rottlerin 在其他细胞类型中被报道发挥脱靶效应，研究推断抑制 PKD 可能是评估在该通路中操纵该节点的功能后果的最佳方法。因此，使用细胞系统方法研究了 CRT0066101 抑制 PKD 激活的功效。在 HAECs 中，苔藓抑素-1 诱导的 p-PKD^S744/S748、p-PKD^S916 和 p-eNOS^S1177 被 CRT 处理同时消除（图3 A-D）。基于这些结果，在没有和有 CRT 的情况下完成了腔内血流介导的血管舒张实验，以评估 PKD 抑制的功能后果。结果表明，在苔藓抑素-1 存在的情况下，通过与 PKD 抑制剂 CRT 同孵育，腔内血流介导的血管舒张在具有遗传性（图3 E）或衰老相关（图3 F）的 EC自噬受损的小鼠的动脉中被阻止，并且在两种模型中血管平滑肌功能都完好无损（图3 G）。苔藓抑素-1 改善了老年小鼠的实质小动脉血管舒张（图3 H）。这些数据表明，苔藓抑素-1 激活 PKC/PKD 信号以改善 EC 自噬受抑制的小鼠的动脉功能。

图3 CRT0066101 可减弱苔藓抑素-1 诱导的 p-PKDS744/748、p-PKDS916、p-eNOSS1177 和腔内血流介导的血管舒张。

图4 图形概要

总之，该研究表明，剪切应力诱导的 eNOS（p-eNOSS1177）磷酸化激活被 PKC 激动剂苔藓抑素-1 恢复，否则会因敲低 ECs 中的自噬相关基因3（Atg3）而抑制；在遗传和年龄相关的 EC 自噬受损的小鼠模型中，苔藓抑素-1 可以逆转股动脉和脑动脉显示的血管舒张抑制；苔藓抑素-1 激活 PKC/PKD 信号以改善 EC 自噬受抑制的小鼠的动脉功能。这些发现提供了证据，证明刺激 PKC/PKD 具有恢复与 EC 自噬抑制相关的受损内皮功能的战略潜力，如衰老。

参考文献：Cho JM, Park SK, Mookherjee S, Peters EC, Pires PW, Symons JD. Bryostatin-1 improves function in arteries with suppressed endothelial cell autophagy. Geroscience. 2025 Apr 12. doi: 10.1007/s11357-025-01650-5. Epub ahead of print. PMID: 40220153.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40220153/

Journal Impact Factor 5.3 (2023)

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2509-2723

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