Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness

Keywords: Atg7; Osx1-Cre; Sod2; osteocytes; tibia compressive loading.

运动引起的机械负荷，特别是负重冲击，通过刺激成骨细胞（分泌骨基质的细胞）促进骨形成来增加骨量。成骨细胞数量和骨形成的减少是人类和小鼠随着年龄增长而骨量流失的主要因素。衰老机制，如活性氧（ROS）过量或自噬减少，与老化骨骼中骨形成减少有关。骨骼中线粒体（mt）ROS 随着年龄的增长而增加，它们在间充质谱系细胞（包括成骨细胞前体、成骨细胞和骨细胞）中的衰减抵消了老龄小鼠骨量的损失。线粒体呼吸过程中产生的线粒体 ROS 受到涉及超氧化物歧化酶2（Sod2）的抗氧化防御机制的对抗。与 mtROS 对骨骼衰老影响的贡献一致，成骨细胞系细胞中 Sod2 的缺失会降低骨形成和骨量。

自噬，通过回收细胞内成分（如错误折叠的蛋白质或受损的细胞器）来维持细胞功能和体内平衡。在使用牙本质基质蛋白1（Dmp1）-、Osterix 1（Osx1）- 和 I 型胶原α 1（Col1a1）-Cre 靶向细胞的成骨细胞谱系中，缺失必要的自噬相关基因，如Atg7、Atg5 和 RB1CC1，证明了自噬对骨形成的作用。自噬随着年龄的增长而变得不那么有效，并可能导致老龄小鼠的骨形成减少。机械力，如压缩应力和流体剪切应力，已被证明可以增强骨细胞和成骨细胞培养物中的自噬通量。

尽管有证据支持过量的 mtROS 或自噬的降低导致衰老过程中成骨细胞生成和骨量减少，但这些机制是否会特异性影响骨机械反应性仍是未知数。最近，美国阿肯色大学医学院内分泌和代谢学系、生理学和细胞生物学系及肌肉骨骼疾病研究中心的一项实验检查了成骨细胞系细胞中自噬减少或 mtROS 增加是否会损害机械刺激下的成骨反应。研究成果发表于 Aging 期刊题为“Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness”。



首先，比较了幼龄（6 个月）和老龄（21 个月）雌性 C57BL/6J 小鼠对机械刺激的反应，对小鼠左胫骨施加轴向压缩负荷（4 Hz，-7.8 N / -6.6 N），右胫骨用作对照。Micro-CT分析显示，在中轴或距胫腓远端连接处近5毫米处，负荷对幼龄和老龄小鼠的皮质厚度没有显著影响。由于矿化表面和矿物质附着率的增加，通过钙黄绿素-茜素双重标记测量的骨形成率在 6 个月大的小鼠外（骨膜）负荷的胫骨表面增加。在 21 个月大小鼠的负荷胫骨中也检测到这些成骨作用，然而，老龄小鼠负荷诱导的骨形成率的幅度显著降低。

此外，还研究了超过骨骼在正常日常活动中经历的更高程度的压力如何影响老龄小鼠的机械反应性，即对6 月龄和 21 月龄雌性 C57BL/6J 小鼠的左胫骨分别加载 -10N 和 -8.5N 的压缩负荷。由于骨膜周长增加，两周的负荷增加了幼龄小鼠负荷胫骨中轴和近端部位的皮质厚度，而在骨内膜表面没有发现影响（图1 A、B）。老龄老鼠的负荷也引起了类似的效果，然而，显微 CT 观察到老龄小鼠在其负荷的胫骨中形成了编织骨。这种现象通常发生在骨骼损伤的反应，例如微骨折。组织形态学分析证实了不规则编织骨的形成，尤其是在骨膜表面（图1 C）。这些结果表明，衰老会降低骨膜对机械刺激的成骨反应，与年轻骨骼相比，衰老骨骼响应增加的机械需求而形成新骨骼的能力大大减弱。
 

图1 较高的机械应变导致老龄小鼠骨膜编织骨形成。

接下来，研究了 Sod2 缺失引起的过量 mtROS 是否会损害响应机械负荷的成骨反应，在成骨细胞系细胞中生成 Sod2 缺失小鼠（Sod2^ΔOsx1）。定量 RT-PCR 分析证实，Sod2^ΔOsx1 小鼠骨髓来源的成骨细胞培养物中 Sod2 mRNA 表达水平降低，且Sod2 的减少增加了 mtROS 水平。

然后，将 12 月龄的雌性 Sod2^ΔOsx1 小鼠及其 Osx1-Cre 对照小鼠的左胫骨以 -8.5N 加载两周，发现负荷增加胫骨近端和中轴的皮质厚度。一致地，在骨髓面积、总面积、皮质面积、极性惯性矩或胫骨中轴的物质密度方面，没有观察到基因型相关的差异。Sod2^ΔOsx1 和 Osx1-Cre 小鼠在负荷的胫骨骨膜和骨内膜表面增加的骨形成率、矿化表面和矿物质附着率没有区别（图2 A-C）。这些结果表明，成骨细胞系细胞中 mtROS 的增加不足以影响骨合成代谢对机械刺激的反应。
 

图2 成骨细胞谱系中过量的线粒体 ROS 不会影响负荷诱导的骨形成。

最后，为了验证成骨细胞中的自噬减少是否可能解释衰老过程中负荷诱导的骨形成降低，构建 Atg7^ΔOsx1 小鼠。为了确认自噬的抑制，使用免疫印迹分析测量了成骨细胞培养物中 LC3 和 p62 的水平（图3 A）。LC3-I 到 LC3-II 的转化通常用作自噬水平的指标。p62 是一种经典的自噬底物，将细胞内自噬物质运输到自噬体进行降解，p62水平升高通常被认为是自噬活性受到抑制的标志。结果表明，表达Osx1-Cre的细胞中Atg7的缺失抑制了自噬体的形成，从而抑制了自噬，如LC3转化和p62积累减少所示（图3 A）。

之前已经表明，Atg7 的缺失会大大降低皮质骨中的树突连接。据推测，骨细胞网络的退化会损害骨合成代谢对负荷的反应。因此，评估了骨细胞突起的密度，这是骨细胞嵌入骨基质时形成的（图3 B）。与 Osx1-Cre 对照相比，Atg7^ΔOsx1 小鼠的平均荧光强度归一化到骨区域，指示骨细胞突起的数量和大小显著降低（图3 C）。这些发现证实，成骨细胞谱系中 Atg7 的缺失会破坏骨细胞网络的形成或维持。此外，Atg7^ΔOsx1 小鼠的骨细胞体比对照组大（图3 C），这可能是由于细胞质成分的积累，这些成分通常在从成骨细胞转变为骨细胞的过程中被降解。

进一步地，分别用 -7.3 N 和 -7.6N 加载 10 月龄的雌性 Atg7ΔOsx1 小鼠和 Osx1-Cre 对照小鼠的左胫骨。两周的负荷增加了 Atg7ΔOsx1 小鼠和 Osx1-Cre 小鼠胫骨中轴和近端的皮质厚度。在髓质面积、总面积、极惯性矩或负荷胫骨中轴的物质密度方面，没有观察到基因型相关的差异。此外，在 Atg7ΔOsx1 和 Osx1-Cre 小鼠中，负荷增加了骨膜和骨内膜表面的骨形成率、矿化表面和矿物质附着率，其程度相似。这些结果表明，成骨细胞系细胞中自噬的减少不足以改变机械刺激下的成骨反应。
 

图3 成骨细胞系细胞中的 Atg7 缺失会破坏骨细胞网络。

总之，该研究表明，成骨细胞中 mtROS 的增加或 Atg7-依赖性自噬的减少，以及骨细胞树突数量减少——骨骼老化的常见特征——不会导致衰老过程中的机械反应性降低。在肌肉中，与低烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）水平相关的线粒体代谢改变与老年人身体活动的反应降低有关。对老龄小鼠施用 NAD + 前体可减轻骨量的损失。刺激 NAD+ 是否也能促进骨骼机械反应性需要未来进一步研究。

参考文献：Resende-Coelho A, Ali MM, James A, Warren A, Gatrell L, Kadhim I, Fu Q, Xiong J, Onal M, Almeida M. Mitochondrial oxidative stress or decreased autophagy in osteoblast lineage cells is not sufficient to mimic the deleterious effects of aging on bone mechanoresponsiveness. Aging (Albany NY). 2025 Mar 18;17(3):610-629. doi: 10.18632/aging.206213. Epub 2025 Mar 18. PMID: 40105873; PMCID: PMC11984430.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40105873/

Online ISSN: 1945-4589

IF：5.9

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