抗猪乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体抗体结构与制备流程

2025-07-07 来源:本站点击次数:43

抗猪乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）E 蛋白单克隆抗体（mAb）是针对 JEV envelope（E）蛋白的特异性抗体，在猪乙型脑炎的诊断、病毒机制研究及防控中具有重要作用。以下从抗体结构、靶向 E 蛋白特征、制备流程、特异性及关键参数等方面详细说明：

一、抗体结构特征

抗 JEV E 蛋白单克隆抗体多为鼠源 IgG 类抗体（常见亚型为 IgG1、IgG2a），少数为 IgM（但因稳定性较差，应用较少），其基本结构如下：

整体结构：由 2 条重链（H 链）和 2 条轻链（L 链）通过二硫键连接形成 “Y” 型结构，分子量约 150 kDa（IgG）。
功能区域：
- 可变区（V 区）：重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）组成抗原结合位点（CDR 区），负责特异性识别 E 蛋白的线性或构象表位（E 蛋白的中和表位多为构象表位，依赖蛋白空间结构）。
- 恒定区（C 区）：重链恒定区（CH1-CH3）决定抗体效应功能（如 IgG2a 的 Fc 段可介导抗体依赖的细胞毒性（ADCC）或补体激活），轻链恒定区（CL）辅助维持结构稳定。
关键修饰：部分单抗的 Fc 段存在 N - 糖基化，影响抗体半衰期（体内应用时）和与 Fc 受体的结合能力。

二、靶向的 E 蛋白及毒株

JEV 的 E 蛋白是病毒包膜表面的主要糖蛋白，全长约 500 个氨基酸，负责病毒吸附、侵入宿主细胞及诱导中和抗体，是疫苗和诊断试剂的核心靶标。抗 E 蛋白单抗的靶向对象包括：

1. E 蛋白的核心表位

E 蛋白分为 3 个结构域（I、II、III）：

2. 靶向的 JEV 毒株

JEV 分为 5 个基因型（GI-GV），我国流行株以 GI（尤其是 GI-b 亚型）和 GIII 为主，E 蛋白序列保守性较高（不同基因型间同源性约 80%-90%）。单抗可识别的常见毒株包括：

三、制备流程及关键参数
1. 制备步骤

免疫原制备：优先选择重组 E 蛋白（纯度≥95%，浓度 80-100μg / 剂，需验证构象完整性），或灭活 JEV 病毒（滴度≥10⁷ PFU/mL）。
动物免疫：BALB/c 小鼠腹腔免疫，基础免疫 3 次（间隔 2 周），加强免疫 1 次（融合前 3 天），血清效价需≥1:10⁴（间接 ELISA 检测，以重组 E 蛋白为包被抗原）。
细胞融合：取免疫小鼠脾脏 B 细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合，融合率≥40%，杂交瘤克隆形成率≥60%。
筛选与克隆：
- 初筛：间接 ELISA（检测针对重组 E 蛋白的抗体）。
- 复筛：免疫荧光（IFA，检测感染 JEV 的 BHK-21 或 C6/36 细胞中的特异性荧光）、中和试验（检测对活病毒的中和活性，NT₅₀≥1:32 为阳性）。
- 克隆纯化：有限稀释法克隆 3 次以上，确保单克隆性（染色体数目稳定，约 90-105 条）。
抗体生产：腹水诱生（效价 1:10⁶-10⁸）或无血清悬浮培养（浓度 30-150μg/mL），经 Protein A/G 亲和纯化后纯度≥95%。

2. 制备关键参数

四、特异性与交叉反应率
1. 特异性

2. 交叉反应率

与其他黄病毒：JEV 与登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）的 E 蛋白存在部分同源序列，需通过 ELISA 排除交叉（对 DENV/ZIKV 的交叉反应率≤3%，即 OD 值比值 < 0.03）。
与不同基因型 JEV：优质单抗可交叉识别 GI-GV 型毒株（因 E 蛋白保守表位），对 GI 和 GIII 型毒株的识别率≥95%，对 GV 型的交叉率≥90%。

五、其他核心参数

亲和力：通过 SPR 或 ELISA 竞争法测定，解离常数（KD）通常为 10⁻⁹-10⁻¹¹ M（KD 值越小，亲和力越高，中和活性越强）。
中和活性：在细胞水平可有效抑制 JEV 感染，50% 抑制浓度（IC₅₀）≤0.5μg/mL（针对 100 TCID₅₀的病毒）。
热稳定性：37℃放置 5 天，效价保留率≥85%；-20℃冻存 2 年，活性无显著下降。
应用适应性：适用于 ELISA、IFA、Western blot（仅识别变性 E 蛋白的单抗）、病毒中和试验等，工作浓度范围：ELISA 1:5000-1:20000，IFA 1:1000-1:5000。

六、应用场景

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