抗经典猪瘟单克隆抗体抗体结构、靶向抗原、制备流程及应用参数
2025-07-07 来源:本站 点击次数:51一、抗体结构特征
- 整体结构：由 2 条重链（H 链，约 50 kDa）和 2 条轻链（L 链，约 25 kDa）通过二硫键连接形成 “Y” 型结构，分子量约 150 kDa（IgG）。
- 功能区域：
- 可变区（V 区）：重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）组成抗原结合位点（CDR1-CDR3），负责特异性识别 CSFV 抗原的线性或构象表位（E2 蛋白的中和表位多为构象表位，依赖蛋白空间结构）。
- 恒定区（C 区）：重链恒定区（CH1-CH3）决定抗体效应功能（如 IgG2a 的 Fc 段可介导补体依赖的细胞毒性（CDC）或调理作用），轻链恒定区（CL）辅助维持结构稳定。
- 修饰特征：部分单抗的 Fc 段存在 N - 糖基化修饰，影响抗体在体内的半衰期（若用于被动免疫）和与 Fc 受体的结合能力。
- E2 蛋白：全长约 370 个氨基酸，含多个中和表位（如 A、B、C、D 表位），其中 A 表位（位于 N 端）是中和活性的核心区域，多数具有中和功能的单抗靶向此表位。E2 蛋白高度保守（不同毒株间同源性约 80%-95%），但疫苗株与野毒株的表位可能存在细微差异（可用于区分免疫与感染）。
- 其他抗原：少数单抗靶向 E0 蛋白（参与病毒释放）或 Core 蛋白（用于病毒核酸检测的辅助验证），但因 E0 和 Core 的免疫原性较弱，应用范围较窄。
- 疫苗株：C 株（兔化弱毒疫苗，2.1 亚型，E2 蛋白序列稳定，是单抗制备的常用免疫原）、HCLV 株（猪瘟兔化弱毒疫苗）。
- 野毒株：石门株（强毒，1.1 亚型）、Alfort 株（1 型）、Brescia 株（1 型）、GLV 株（2 型）等。
- 重组抗原：通过杆状病毒 - 昆虫细胞、CHO 细胞表达的重组 E2 蛋白（保留天然构象，含完整中和表位），是单抗制备的首选免疫原（纯度高、安全性好）。
1. 制备步骤
- 免疫原制备：优先选择重组 E2 蛋白（纯度≥95%，浓度 50-100μg / 剂，需验证构象表位完整性），或灭活 CSFV 病毒（滴度≥10⁶ TCID₅₀/mL，需无残留毒力）。
- 动物免疫：BALB/c 小鼠腹腔免疫，基础免疫 3 次（间隔 2 周），加强免疫 1 次（融合前 3 天），血清效价需≥1:10⁴（间接 ELISA 检测，以重组 E2 蛋白为包被抗原）。
- 细胞融合：取免疫小鼠脾脏 B 淋巴细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合，融合率≥30%，杂交瘤克隆形成率≥50%。
- 筛选与克隆：
- 初筛：间接 ELISA（检测针对重组 E2 蛋白的抗体）。
- 复筛：免疫荧光（IFA，检测感染 CSFV 的 PK-15 细胞中的特异性荧光）、中和试验（检测对活病毒的中和活性，中和效价≥1:16 为阳性）。
- 克隆纯化：有限稀释法克隆 3 次以上，确保单克隆性（染色体数目稳定，约 90-110 条）。
- 抗体生产：腹水诱生（效价 1:10⁶-10⁸）或无血清悬浮培养（浓度 20-100μg/mL），经 Protein A/G 亲和纯化后纯度≥95%。
- 杂交瘤稳定性：连续传代 60 次后，抗体分泌能力无显著下降（效价波动≤20%）。
- 抗体效价：ELISA 效价（腹水）≥1:10⁶，中和效价（针对强毒株）≥1:32。
1. 特异性
- 抗原特异性：仅与 CSFV 的靶抗原（如 E2）结合，不识别 CSFV 的非结构蛋白（如 NS3、NS5）或其他病毒（如猪繁殖与呼吸综合征病毒 PRRSV、猪伪狂犬病病毒 PRV）的抗原。
- 病毒特异性：通过 IFA 和中和试验验证，仅与 CSFV 反应，不与同属的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、边界病病毒（BDV）交叉反应（因三者 E2 蛋白存在部分同源序列，需严格排除交叉）。
- 与同属病毒：优质单抗对 BVDV、BDV 的交叉反应率≤5%（ELISA 检测 OD 值比值 < 0.05）。
- 与不同基因型 CSFV：因 E2 蛋白保守性高，单抗通常可交叉识别 1-3 型毒株，对 1 型和 2 型毒株的识别率≥90%，对 3 型的交叉率≥85%。
- 区分疫苗株与野毒株：部分单抗可识别野毒株特有的表位（如石门株的 D 表位），对疫苗株（C 株）无反应，交叉率≤1%，可用于 “鉴别诊断（DIVA）” 试剂。
- 亲和力：通过 SPR（表面等离子体共振）或 ELISA 竞争法测定，解离常数（KD）通常为 10⁻⁸-10⁻¹⁰ M（KD 值越小，亲和力越高，中和活性越强）。
- 中和活性：在细胞水平可有效抑制 CSFV 感染，50% 抑制浓度（IC₅₀）≤1μg/mL（针对 100 TCID₅₀的病毒）。
- 热稳定性：37℃放置 7 天，效价保留率≥80%；-20℃冻存 3 年，活性无显著下降。
- 应用适应性：适用于 ELISA（检测抗原或抗体）、IFA（病毒定位）、Western blot（仅识别变性抗原的单抗）、病毒中和试验等，工作浓度范围：ELISA 1:2000-1:10000，IFA 1:500-1:2000。
- 诊断试剂：作为核心试剂用于 CSFV 抗原检测（如双抗体夹心 ELISA）、病毒分型及 “免疫 - 感染” 鉴别诊断。
- 基础研究：解析 E2 蛋白的功能（如与宿主细胞受体结合机制）、病毒入侵途径。
- 被动免疫：高中和活性的单抗可用于仔猪紧急预防或发病猪的早期治疗（需验证安全性和半衰期）。
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