非洲猪瘟病毒P54蛋白抗体抗体结构、对应毒株及制备方法
2025-07-08 来源:本站 点击次数:99
一、非洲猪瘟 P54 蛋白的背景
二、抗 P54 蛋白抗体的结构
1. 单克隆抗体制备
- 基本结构：由两条重链（H 链）和两条轻链（L 链）通过二硫键连接形成 “Y” 型免疫球蛋白结构。
- 功能区域：
- 可变区（V 区）：位于 “Y” 型顶端，由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）组成，负责特异性识别 P54 蛋白的抗原表位（线性或构象表位），是抗体靶向结合的核心区域。
- 恒定区（C 区）：包括重链恒定区（CH1-CH3）和轻链恒定区（CL），决定抗体的类型（如 IgG、IgM 等）和效应功能（如激活补体、结合 Fc 受体等）。
- 常见类型：应用中以 IgG 型单克隆抗体为主，因其稳定性高、亲和力强，适合用于诊断试剂开发和实验室检测。
- 基因 Ⅱ 型：目前在我国及全球广泛流行的主流毒株（如 Georgia 2007 株及其变异株）。
- 基因 Ⅰ 型：西非、欧洲部分地区流行的毒株（如 L60 株、BA71V 株）。
- 其他基因型毒株：如基因 Ⅲ 型至 ⅩⅧ 型（覆盖非洲、欧洲等地流行株），由于 P54 蛋白序列变异较小，抗体对多数毒株均有交叉识别能力，但具体识别范围需通过实验验证（如针对变异位点的抗体可能对特定毒株识别能力下降）。
1. 单克隆抗体制备
- 免疫原制备：通过原核表达系统（如大肠杆菌）或真核表达系统（如昆虫细胞、HEK293 细胞）重组表达 P54 蛋白（全长或优势抗原表位片段），经纯化后作为免疫原。
- 杂交瘤细胞构建：
- 用重组 P54 蛋白免疫 Balb/c 小鼠，多次免疫后取脾脏淋巴细胞，与骨髓瘤细胞（如 SP2/0）融合，通过有限稀释法筛选能稳定分泌抗 P54 抗体的杂交瘤细胞株。
- 抗体纯化：从杂交瘤细胞培养上清或小鼠腹水（腹腔接种杂交瘤细胞获得）中，采用蛋白 A/G 亲和层析、离子交换层析等方法纯化，获得高纯度单克隆抗体。
- 以重组 P54 蛋白免疫兔、羊等动物，定期采血分离血清，通过亲和层析去除非特异性抗体，获得多克隆抗体。其优势是可识别 P54 蛋白的多个抗原表位，灵敏度较高，但特异性略低于单克隆抗体。
- 与 ASFV 的特异性结合：能特异性识别 ASFV 感染细胞中的 P54 蛋白或病毒粒子，不与其他猪源病毒（如猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒等）发生交叉反应，这是其用于 ASF 特异性诊断的核心基础。
- 表位特异性：单克隆抗体通常针对 P54 蛋白的单一抗原表位（如特定氨基酸序列组成的线性表位，或依赖空间结构的构象表位），多克隆抗体则可识别多个表位，因此在检测中可根据需求组合使用（如单克隆抗体用于精准定性，多克隆抗体用于提高检测灵敏度）。
- 与其他病毒的交叉反应：由于 P54 蛋白是 ASFV 特有的蛋白，且与其他病毒的蛋白序列同源性极低，抗 P54 抗体与其他猪病毒的交叉反应率极低（通常 < 1%），确保了诊断的特异性。
- 与不同 ASFV 毒株的交叉反应：因 P54 蛋白在 ASFV 各毒株中保守性较高（氨基酸序列同源性通常 > 90%），优质抗 P54 抗体对不同基因型毒株的交叉反应率较高（一般 > 85%），可覆盖全球主流流行毒株。但需注意，少数变异毒株若在 P54 蛋白的抗原表位区域发生突变，可能导致交叉反应率下降，因此需结合当地流行毒株的序列进行验证。
- 诊断试剂开发：用于 ASF 的血清学检测（如 ELISA 检测抗体）或病毒抗原检测（如免疫荧光试验、胶体金试纸条、免疫组化），是 ASF 快速筛查和确诊的重要工具。
- 病毒学研究：通过抗体标记技术（如免疫荧光、免疫电镜）定位 P54 蛋白在细胞内的分布，研究其在病毒复制周期中的功能；或用于病毒中和试验，探索其在抑制病毒感染中的作用。
- 疫苗评价：作为免疫应答指标，通过检测抗 P54 蛋白抗体水平，评估候选疫苗诱导的体液免疫效果。
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