非洲猪瘟病毒P72蛋白抗体（单克隆抗体）在 ASF 防控中的应用
2025-07-08 来源:本站 点击次数:96非洲猪瘟病毒（ASFV）的 P72 蛋白（由 B646L 基因编码）是病毒最主要的结构蛋白，构成病毒粒子的衣壳，具有极高的保守性和免疫原性，是非洲猪瘟（ASF）诊断、病毒检测及基础研究的核心靶标之一。针对 P72 蛋白的抗体（尤其是单克隆抗体）在 ASF 防控中应用广泛，以下从多维度详细解析：
一、P72 蛋白的核心特征
- 维持病毒粒子的结构稳定性；
- 参与病毒对宿主细胞的识别与吸附；
- 作为病毒最保守的蛋白之一，在不同基因型 ASFV 中氨基酸序列同源性高达 90% 以上，是跨毒株检测的理想靶标。
- 由两条重链（H 链）和两条轻链（L 链）通过二硫键连接，形成典型的 “Y” 型结构。
- 分子量约 150 kDa（IgG 型），其中重链约 50 kDa，轻链约 25 kDa。
- 可变区（V 区）：位于 “Y” 型顶端，由重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）组成，负责特异性识别 P72 蛋白的抗原表位（线性表位或构象表位），是抗体靶向结合的关键区域。
- 恒定区（C 区）：包括重链恒定区（CH1-CH3）和轻链恒定区（CL），决定抗体的类型（如 IgG1、IgG2a 等亚型）及效应功能（如结合 Fc 受体、激活补体等）。
- 单克隆抗体以 IgG 型为主（如小鼠 IgG1、IgG2b），因其稳定性强、亲和力高，适合用于诊断试剂；
- 多克隆抗体多为兔源或羊源 IgG，可识别 P72 的多个表位，灵敏度更高。
- 基因 Ⅱ 型：全球主流流行株（如 Georgia 2007 株、我国流行的变异株）；
- 基因 Ⅰ 型：西非、欧洲经典株（如 L60 株、BA71V 株）；
- 其他基因型：基因 Ⅲ-ⅩⅧ 型（非洲地方性流行株）。
其跨毒株识别能力源于 P72 蛋白的高度保守性（不同基因型间氨基酸序列同源性 > 90%），是 ASF 通用诊断的核心依据。
1. 单克隆抗体制备
- 免疫原：通过原核表达（大肠杆菌）或真核表达（昆虫细胞、HEK293）系统重组表达 P72 全长蛋白或优势抗原片段（如第 1-300 位氨基酸），纯化后作为免疫原。
- 杂交瘤构建：
- 用重组 P72 蛋白免疫 Balb/c 小鼠，多次免疫后取脾脏淋巴细胞；
- 与骨髓瘤细胞（如 SP2/0）融合，通过 HAT 选择培养基筛选杂交瘤细胞；
- 采用 ELISA、Western blot 等方法筛选能特异性结合 P72 蛋白的阳性克隆，经有限稀释法克隆化，获得稳定分泌抗体的细胞株。
- 抗体纯化：从杂交瘤细胞上清或小鼠腹水（腹腔接种杂交瘤细胞）中，通过蛋白 A/G 亲和层析纯化，纯度可达 95% 以上。
- 以重组 P72 蛋白免疫兔、羊等动物，定期采血收集抗血清；
- 用 P72 蛋白偶联的亲和层析柱纯化血清，去除非特异性抗体，获得多克隆抗体。其优势是可识别多个表位，灵敏度高，但批次差异较大。
- 与 ASFV 的特异性结合：仅识别 ASFV 感染细胞或病毒粒子中的 P72 蛋白，不与其他猪源病毒（如猪瘟病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒等）发生交叉反应，确保诊断的专一性。
- 表位特异性：单克隆抗体通常针对 P72 蛋白的单一表位（如线性表位 “Gly120-Ser135” 或构象表位），多克隆抗体则覆盖多个表位，可根据需求组合使用（如双抗体夹心法中，捕获抗体和检测抗体针对不同表位，提高检测特异性）。
- 与其他病毒的交叉率：极低（通常 < 0.1%），因 P72 蛋白是 ASFV 特有，与其他病毒无同源序列，故无交叉反应。
- 与不同 ASFV 毒株的交叉率：极高（通常 > 95%），由于 P72 蛋白高度保守，优质抗体可识别所有已知基因型毒株。仅当个别毒株的 P72 抗原表位发生罕见突变（如氨基酸替换）时，可能导致交叉率下降（但此类情况极少）。
- 亲和力：单克隆抗体的亲和力常数（Ka）通常为 10⁸-10¹⁰ L/mol，确保与 P72 蛋白的高效结合；
- 效价：ELISA 效价（终点稀释倍数）可达 1:10⁶以上（单克隆抗体上清）或 1:10⁷以上（多克隆抗血清）；
- 稳定性：在 - 20℃可保存 2 年以上，4℃可稳定 6 个月，适合产业化应用。
- 诊断试剂：是 ASF 抗原检测（如 ELISA、胶体金试纸条、荧光定量 PCR 配套抗体）和抗体检测的核心试剂，可用于猪群筛查、病毒溯源；
- 基础研究：通过免疫荧光、免疫电镜定位 P72 蛋白在细胞内的分布，研究其在病毒组装、入侵中的功能；
- 疫苗研发：作为评价候选疫苗免疫效果的指标（如检测免疫猪群的抗 P72 抗体水平）。
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