• 外膜蛋白（OMPs）：如 OspA、OspB、OspC 等，参与蜱媒介定植与宿主感染。
• 鞭毛蛋白（FlaB）：介导螺旋体运动，与侵袭力相关。
• 热休克蛋白（Hsp）：如 DnaK，参与应激存活。
• 黏附蛋白（如 P66）：结合宿主细胞外基质（ECM），促进组织定植。

• 天然 OspA 结构： 
  • 跨膜拓扑：由 270-300 个氨基酸组成，形成 “发夹状”β- 桶结构，含 8 个跨膜 β- 折叠，N 端和 C 端均位于周质空间，中间环区暴露于外膜表面。
  • 抗原表位分布：表面环区（如 Loop 1、Loop 4）富含半胱氨酸，形成二硫键稳定的抗原结构，是宿主抗体识别的主要区域，但易发生抗原变异（如氨基酸替换或糖基化修饰）。
• 重组 OspA 结构：原核表达时通常去除 N 端信号肽（约 20 个氨基酸），保留成熟肽段（约 250 个氨基酸），以可溶性或包涵体形式存在，需通过圆二色谱（CD）验证 β- 折叠含量（约 40%-45%）。

• 天然 OspA：成熟肽段理论分子量约 31-32 kDa，因脂质修饰（N 端 Cys 连接脂肪酸）实际分子量约 34-36 kDa，SDS-PAGE 中迁移率略慢于理论值。
• 重组 OspA（无修饰）：去除信号肽后分子量约 29-30 kDa，纯化后 SDS-PAGE 显示单一 30 kDa 条带。

• 阶段特异性表达：OspA 在蜱媒介中高表达，帮助螺旋体在蜱肠上皮定植；感染宿主后，OspA 表达下调，被 OspC 等替代，形成免疫逃逸（抗原转换机制）。
• 交叉反应性：与其他疏螺旋体（如B. burgdorferi）的 OspA 有 40%-60% 序列同源性，可能导致血清学诊断的假阳性。

• 蜱 - 宿主传播媒介：OspA 与蜱肠细胞表面的脂蛋白受体（如 TROSPA）结合，是螺旋体在蜱体内存活的关键因子。
• 抗血清杀伤作用：天然 OspA 可激活补体依赖的杀菌作用，但重组 OspA 因缺乏脂质修饰，补体激活效率降低。

• 热稳定性较差：55℃处理 15 分钟即开始变性，需在 4℃或 - 20℃（添加甘油）保存；耐蛋白酶水解能力强（β- 桶结构抵抗蛋白酶切割）。

• 可溶性表达纯化流程： 
  • 诱导表达：IPTG（0.1-1 mM）诱导 4-6 小时，30℃低温可提高可溶性表达（减少包涵体形成）。
  • 破菌与上清获取：高压均质或超声破碎，4℃离心（12,000×g）30 分钟，收集上清液。
  • 亲和层析（首选）： 
    • 融合 His-tag 时，使用 Ni-NTA 柱：平衡液（20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 10 mM 咪唑，pH 7.4）洗涤，250 mM 咪唑洗脱，纯度达 80%-85%。
    • 融合 GST-tag 时，用谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化，10 mM 还原型谷胱甘肽洗脱。
  • 离子交换层析（精纯）：利用 OspA 的 pI 约 6.5-7.0，通过 Q Sepharose 柱（阴离子交换）在低盐条件下结合，梯度 NaCl（0-1 M）洗脱，纯度提升至 95%。
• 包涵体纯化（若不可溶）： 
  • 8M 尿素溶解包涵体，Ni-NTA 柱纯化后，通过梯度透析复性（添加 5% 甘油和 0.1 mM DTT 防止聚集），复性效率约 30%-40%，需 ELISA 验证抗原活性。

• 毕赤酵母分泌表达： 
  • 优势：可实现 N 端脂质修饰（模拟天然 OspA），抗原性更接近天然蛋白。
  • 纯化：培养上清经离心、0.22 μm 过滤后，通过 Ni-NTA 亲和层析或疏水层析（HiTrap Phenyl）纯化，纯度达 90% 以上，适用于疫苗研究。

• SDS-PAGE 与 WB：纯化蛋白在 30 kDa 处显影，与牛疏螺旋体阳性血清特异性结合（WB 条带清晰），与阴性血清无交叉反应。
• ELISA 检测：包被重组 OspA（5 μg/mL）可检测牛血清中的特异性 IgG，与间接免疫荧光（IFA）的符合率达 85%，适用于蜱传疏螺旋体病的现场筛查。

• 诊断试剂：重组 OspA 作为包被抗原，用于 ELISA 试剂盒检测牛血清抗体，早期感染（蜱叮咬后 1-2 周）即可检出，比传统培养法更灵敏。
• 疫苗研发：OspA 疫苗在实验动物中可诱导产生中和抗体，阻止蜱媒介传播，但因天然抗原变异，需多表位嵌合设计以提高保护效力。
• 致病机制研究：通过重组 OspA 突变体（如 Loop 区点突变）研究其与蜱受体的结合机制，为阻断传播提供靶点。

• 由 350-380 个氨基酸组成，形成螺旋状纤维结构，分子量约 40-42 kDa，重组表达（大肠杆菌）时去除信号肽后约 38 kDa，SDS-PAGE 迁移率与理论值一致。

• 抗原性：FlaB 是保守抗原，不同疏螺旋体菌株间同源性＞70%，可作为属特异性诊断抗原，但免疫原性较弱（Th1 型应答为主）。
• 纯化方式：同 OspA，采用 His-tag 亲和层析 + 凝胶过滤（Superdex 200），纯度可达 90%，适用于属水平的血清学筛查（如区分疏螺旋体与其他螺旋体）。

牛疏螺旋体蛋白（如 OspA、FlaB）的结构变异性和功能多样性是其致病与传播的关键。重组蛋白技术（尤以大肠杆菌表达系统为核心）通过优化表达与纯化工艺，可获得高纯度抗原，用于血清学诊断（如 ELISA）和疫苗研发。其中，OspA 因在蜱媒介中的关键作用成为阻断传播的重要靶点，而 FlaB 等保守蛋白则适用于属水平的病原检测。未来研究需关注抗原表位的多样性与修饰机制，以提升诊断试剂的特异性和疫苗的保护效率。