光片线扫描结构光照明显微镜实现活体组织中亚细胞结构的高对比度成像
2025-08-04 来源:本站 点击次数:187本研究成果由Patrick Byers、Thomas Kellerer、MiaomiaoLi、Zhifen Chen、Thomas Huser和Thomas Hellerer团队完成，题为《Super-resolution upgrade for deep tissue imaging featuring simple implementation》，于2025年6月在线发表于Nature Communications期刊。
重要发现
01核心技术原理
LiL-SIM的创新性设计包含三个关键突破：
光路改造：在传统双光子显微镜光路中添加柱面镜生成线聚焦照明，通过多夫棱镜和半波片组成的旋转模块实现照明图案的0°、60°、120°三角度旋转。多夫棱镜的机械旋转角度α可转化为2α的光场旋转，确保照明方向精确控制。
光片快门模式（LSS）：sCMOS相机的LSS模式将曝光限制在照明线扫描的相邻7个像素带（带宽≈455nm），有效抑制散射荧光背景。与传统滚动快门（RS）模式相比，LSS在斑马鱼样本40μm深度处将调制对比度从0.07提升至0.2。
序列线扫描替代干涉条纹：通过步进式扫描单线焦点构建照明图案（非干涉产生），规避了生物组织中相位畸变对干涉条纹对比度的干扰。
02分辨率与深度突破分辨率验证：使用100×/1.49NA物镜成像190nm荧光微珠，LiL-SIM结合去卷积算法将分辨率从275nm（常规双光子成像）提升至189–196nm。线对测试表明可解析150nm间距结构。
深层组织成像：在斑马鱼样本中，LSS模式将调制对比度维持阈值（>0.1）的成像深度从RS模式的<2μm扩展至56μm。小鼠心肌组织成像中，LiL-SIM在70μm深度清晰分辨出肌动蛋白纤维（间距≈146nm）。
03生物样本验证松木组织（Pinusradiata）：在30μm深度处，LiL-SIM将树脂导管细胞壁分辨率从299nm提升至156nm，傅里叶环相关（FRC）分析确认分辨率为163nm。
小鼠心肌：70μm深度处仍可分辨肌动纤维网络，而传统宽场成像（WiL-2PM）因散射背景无法重建超分辨信息。
创新与亮点
01突破散射组织成像瓶颈
传统结构光照明显微镜（SIM）在深层组织中因荧光散射导致调制对比度急剧下降。LiL-SIM首创将sCMOS相机的LSS模式与双光子线扫描结合：
LSS的物理屏障作用：仅曝光照明线邻近区域，彻底阻断散射光子污染，使调制对比度在56μm深度仍满足超分辨重建需求（>0.1）。
双光子激发的天然优势：非线性激发仅聚焦区域产生信号，规避荧光回程散射对成像的影响。
02低成本简易改装方案通用性设计：仅需在现有双光子显微镜上加装柱面镜（≈$200）、多夫棱镜（≈$300）和sCMOS相机（≈$15k），无需自适应光学或专用物镜。
灵活的参数调控：通过扫描电压调节图案间距，支持40×/1.15NA至100×/1.49NA多种物镜。
03为活体研究开辟新路径深度-分辨率平衡：在70μm深度实现150nm分辨率，超越现有技术（如光学光子重分配显微镜-OPRA的1.44倍、多焦点结构光照明显微镜-MSIM的1.6倍提升）。
多样本兼容性：成功应用于植物（松木）、哺乳动物（小鼠心脏）和模式生物（斑马鱼），支持肌动蛋白、细胞核等多种荧光标记。
总结与展望
LiL-SIM技术通过创新性地融合双光子线扫描照明、光场旋转与LSS检测模式，为深层生物组织超分辨成像提供了高性价比解决方案。其核心价值在于：首次在无需复杂自适应光学的条件下，将超分辨成像深度推进至70μm，分辨率达150nm，并兼容常规荧光标记。
当前技术仍受限于扫描速度（需优化多夫棱镜旋转延时）和光子效率（低双光子截面染料受限），未来可通过振镜K镜替代棱镜、平顶光束整形进一步提升性能。该技术有望推动神经突触、肿瘤微环境等深层动态过程的研究，为生物医学领域提供“平民化”超分辨成像工具。
论文信息声明：本文仅用作学术目的。
Byers P, Kellerer T, Li M, Chen Z, Huser T, Hellerer T. Super-resolution upgrade for deep tissue imaging featuring simple implementation. Nat Commun. 2025 Jun 25;16(1):5386.
DOI:10.1038/s41467-025-60744-y.