引言

靶向蛋白质降解是一种新策略，旨在出于治疗目的，从细胞中选择性地消除特定蛋白质。虽然最初这项研究主要关注 PROTAC 分子，但如今，新的靶向降解方法正在涌现。其中之一就是降解 TAG （dTAG） 技术。

dTAG是一种创新的靶标验证方法。像PROTACs一样，该方法使用一种异双功能小分子，建立目标蛋白与E3泛素连接酶之间的三元复合物。然而，dTAG技术的独特之处在于，通过CRISPR/Cas9将双功能降解剂的一部分结合位点人工引入到目标蛋白中，这使得dTAG成为进行靶标验证研究、探讨剂量依赖效应的理想工具。

本文所述的dTAG蛋白降解分析使用了双荧光素酶报告系统来测量靶蛋白降解。为此，使用萤火虫荧光素酶作为基准标记物，该标记物不应受到dTAG降解的影响。第二种荧光素酶是纳米荧光素酶（Nanoluciferase），以碎片化的非活性形式（HiBiT）与靶蛋白融合。dTAG降解剂能够通过引入的dTAG结合基序，将靶蛋白与E3泛素连接酶结合，从而形成三元复合物（见图1）。这会导致靶蛋白及其融合的HiBiT片段的泛素化并随之降解。为了测量纳米荧光素酶的荧光发射，在降解后加入LgBiT。这个小的纳米荧光素酶片段可以完成未降解的HiBiT片段，进而形成活性纳米荧光素酶，产生荧光信号。纳米荧光素酶与萤火虫荧光素酶的发射比值则成为dTAG降解剂效能的指示，比例越低，目标降解程度越高。

图 1：dTAG 蛋白质降解测定原理

图 2：dTAG 蛋白质降解测试：测试了三种 dTAG 降解剂诱导靶向 HiBiT 降解的能力。将浓度为 0.1 至 10,000 nM 的 dTAG 降解剂添加到稳定表达 HiBiT 融合蛋白的 HEK 细胞培养物中。4 小时后，依次测量了萤火虫萤光素酶和纳米萤光素酶的化学发光

 
所有测试的dTAG降解剂均以浓度依赖的方式引起了纳米荧光素酶发射量的下降（即HiBiT降解）。然而，不同的dTAG分子在HiBiT降解的程度上有所不同。dTAG-13（绿色曲线）引起约50%的降解和纳米荧光素酶发射量的减少，而dTAG-v1（蓝色曲线）则表现为最强的降解剂，几乎完全降解了HiBiT。

在第二个实验中，进一步评估了dTAG-v1降解剂的数据稳定性（见图3）。在此实验中，评估了1到10 µM浓度范围的dTAG-v1，并进行了32次重复实验，结果与DMSO对照组进行了比较。

图3：dTAG-v1的评估：1到10 µM的dTAG-v1应用于稳定表达HiBiT融合蛋白的HEK细胞，并进行了32次重复实验。用DMSO处理的细胞作为空白对照组。计算dTAG-v1 HiBiT信号的信号与空白比值（S/B值）以及 Z prime ，以评估数据稳定性

 
如图 3 所示，与 DMSO 对照相比，所有三种浓度的 dTAG-v1 均导致 HiBiT 融合蛋白降解。信号与空白比值显示，纳米荧光蛋白化学发光信号随浓度降低而降低，而 Z 因子为 0.84 至 0.87，表明数据稳定性良好。

结论

使用 dTAG 蛋白质降解检测，测试的 dTAG 分子可成功用于诱导 HiBiT 融合蛋白质复合物的靶向降解。由于其高灵敏度、快速读取时间和缩小规模的兼容性，PHERAstar FSX 非常适合此应用，与 iSTAR 板一起使用，性能与类似的酶标仪相当。

图 4：PHERAstar FSX 酶标仪

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