免疫检查点阻断疗法（ICB）是癌症治疗领域的革命性突破，然而目前仅有少数癌症患者能从现有ICB治疗中获益。除T细胞功能障碍外，超过65%的肿瘤存在MHC-I缺失现象，这成为ICB治疗原发性和获得性抵抗的共同机制。MHC-I缺失的细胞应被自然杀伤（NK）细胞清除，但许多肿瘤仍能逃逸NK细胞的杀伤。这一矛盾现象背后的机制尚不明确。


2024年5月，上海寻百汇生物科技有限公司团队在《Cell》（IF：42.5）发表了题为IGSF8 is an innate immune checkpoint and cancer immunotherapy target的研究文章。该研究利用CRISPR技术，筛选出IGSF8为NK细胞检查点，它通过与NK细胞表面KIR3DL2受体的特异性相互作用来抑制NK细胞功能。单独使用抗体阻断IGSF8或联合抗PD1治疗可以显著抑制肿瘤生长，证明IGSF8是一个天然免疫检查点及癌症免疫治疗靶点。

研究亮点

●  IGSF8在抗原呈递缺陷的恶性细胞中高表达

●  IGSF8通过与NK受体相互作用抑制NK细胞毒性

●  抗IGSF8抗体在体外增强NK细胞对恶性细胞的杀伤作用

●  抗IGSF8单药或联合抗PD1治疗在体内抑制肿瘤生长
 

Section.01

共培养CRISPR筛选鉴定IGSF8为NK细胞检查

作者提出假说：MHC-I缺陷的恶性细胞通过表达特定蛋白来抑制NK细胞功能，从而逃避免疫清除。为系统鉴定具有NK细胞检查点功能的蛋白分子，研究人员分别在MHC-I表达正常的COLO205人结肠癌细胞系和MHC-I缺陷的AGS人胃癌细胞系中建立了NK细胞共培养CRISPR筛选体系。通过慢病毒感染两种细胞（COLO205是全基因组敲除文库，而AGS细胞是细胞表面蛋白编码基因敲除文库），单独或者与人原代NK细胞共培养过夜（图1A）。

▲图1 Identification of IGSF8 as a suppressor of NK cell killing

通过高通量测序分析编辑后的COLO205和AGS细胞在NK细胞处理前后的sgRNA丰度变化，并采用MAGeCK算法鉴定两组间差异选择的基因。研究人员对负向选择基因（即敲除后使恶性细胞对NK细胞杀伤更敏感的基因）进行了研究，并确实发现了许多已知能抑制NK细胞杀伤作用的基因。例如，在COLO205细胞中，MHC-I分子（包括与KIR2D家族受体结合的HLA-C、与NKG2A结合的HLA-E）是最显著的负向选择基因（图1B）；两株细胞共有的其他负向选择基因，如EPCAM、CD38、PVR。两株细胞中正向选择基因共同包含了已知的NK细胞活化配体：COLO205中显著富集的是NCR3LG1（又称B7-H6）；AGS中则是ICAM1、MICA/B和CD58（图1C）。这一结果支持了所用方法的可靠性，并验证了NK细胞共培养CRISPR筛选实验的有效性。同时，研究人员也发现了IGSF8在两项筛选中均持续表现为强负向选择基因（图1B）。研究人员在COLO205和AGS细胞系中敲除IGSF8，与NK细胞共培养，发现NK细胞的杀伤效率显著提升（图1D、1E）。IGSF8是一个进化上保守的基因，人与小鼠之间的序列一致性达90%。研究人员敲除B16-F10中的Igsf8，观察到NK细胞杀伤显著增强（图1F和1G），这表明IGSF8对NK细胞的抑制在人与小鼠之间是保守的。Igsf8敲除对B16-F10细胞的体外生长影响很小，但它显著降低了C57BL/6同源小鼠体内肿瘤的生长（图1H）。对肿瘤浸润CD45+细胞的流式分析显示，B16-F10中Igsf8敲除导致NK细胞和CD8 T细胞显著增加，而对巨噬细胞影响很小（图1I）。比较移植17天后有或无Igsf8敲除的B16-F10肿瘤的RNA-seq图谱发现，肿瘤中Igsf8敲除导致NK细胞介导的细胞毒性显著上调，抗原加工呈递和T细胞信号传导增加（图1J）。以上结果表明IGSF8是一种NK细胞检查点和新的免疫治疗靶点。

Section.02

IGSF8通过与特定NK受体相互作用来抑制NK细胞功能

IGSF8蛋白通常与外周血单个核细胞（PBMC）中的静息NK细胞相互作用较弱，但在CRISPR筛选中使用的扩增NK细胞，这种相互作用显著增强（图2A和2B）。研究人员分选了与IGSF8蛋白结合能力处于最低10%和最高90%的扩增NK细胞，通过比较这两个细胞群体的RNA-seq图谱，发现KIR3DL2是差异表达最显著的细胞表面受体（图2C）。在表达六种不同KIR家族成员的Fc融合蛋白实验中，仅KIR3DL2能与过表达IGSF8的小鼠CT26细胞结合（图2D）。扩增后的NK细胞中KIR3DL2表达显著增加（图2E），这与IGSF8蛋白对这些细胞结合增强的现象一致（图2B）。在九名不同供体的扩增NK细胞实验中，研究人员观察到KIR3DL2表达水平与IGSF8结合强度呈显著正相关（图2F）。这些结果共同证实了IGSF8与人NK细胞表面KIR3DL2受体之间存在特异性相互作用。

将扩增的原代NK细胞与过表达IGSF8、HLA-C或HA标签对照的K562细胞共孵育，检测NK细胞脱颗粒水平。结果显示，K562-HLA-C能普遍抑制NK细胞的脱颗粒（无论KIR3DL2表达水平如何），而K562-IGSF8仅特异性抑制KIR3DL2+ NK细胞的脱颗粒（图2G）。使用类似的方法，研究人员发现Ly49家族中的Klra9 mRNA在结合Igsf8蛋白的NK细胞中显著富集（图2H），只有Klra9蛋白能特异性结合CT26-Igsf8细胞（图2I）。

▲图2 Identification of KIR3DL2 and Klra9 as the binding partner of IGSF8 on NK cells

Section.03

IGSF8在多种癌症中的表达情况以及与不良预后的关系

通过对96项研究的肿瘤单细胞RNA-seq数据分析，研究人员进一步证实IGSF8在恶性细胞中表达水平最高（图3B）。相比之下，KIR3DL2在TCGA癌症样本中总体表达量较低且拷贝数变异稀少，但特异性地表达于NK细胞和T细胞（图3B）。在TCGA数据库分析的肿瘤中，IGSF8 mRNA表达与CD8、颗粒酶、穿孔素、CD274（PDL1）以及MHC-I成员B2M呈负相关（图3C）。与癌旁正常上皮细胞相比，恶性细胞（特别是MMRp肿瘤）表现出B2M表达显著降低和IGSF8表达升高（图3D）。更重要的是，我们在同一肿瘤样本的不同恶性细胞中观察到MHC-I与IGSF8蛋白呈现异质性且互斥的表达模式（图3E）。在TCGA数据库的宫颈癌、子宫内膜癌、结肠癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤中，MHC-I低表达肿瘤群体内，高IGSF8表达与更差的生存率显著相关（图3F）。另一项抗PD-1治疗前后黑色素瘤样本的研究表明，治疗有效组的肿瘤组织IGSF8水平显著降低（图3G）。以上结果说明，IGSF8在多种癌症中呈现高表达并与不良临床预后相关。

▲图3 Evaluation of IGSF8 and KIR3DL2 gene expression profiles in patient tumors

Section.04

阻断IGSF8与NK细胞受体相互作用的抗体可增强NK细胞杀伤功能

研究人员开发了一种靶向IGSF8的抗体（IGSF8.06）用于阻断IGSF8与其结合配体的相互作用。该抗体与人类IGSF8具有高亲和力（图4A）。该抗体可特异性阻断KIR3DL2与过表达人源IGSF8的CT26细胞结合（图4B），以及Klra9与过表达小鼠Igsf8的CT26细胞结合（图4C）。Fc沉默型IGSF8.06抗体还能提升PBMC来源NK细胞对过表达IGSF8的K562细胞的杀伤效率（图4D）。随后，研究人员检测了武汉尚恩生物的原代肺癌、结肠癌和肝癌恶性细胞（这些细胞均具有可检测的IGSF8和MHC-I表达），发现IGSF8.06处理同样能增强PBMC来源NK细胞对这些恶性细胞的杀伤（图4E-4G）。为探究IGSF8.06抗体激活NK细胞的作用是否依赖KIR3DL2，研究人员在COLO205或K562-IGSF8恶性细胞与NK92/NK92-KIR3DL2细胞的共培养体系中测试了该抗体。结果显示：IGSF8.06抗体能显著增强NK92-KIR3DL2细胞对COLO205和K562-IGSF8细胞的杀伤，但对野生型NK92细胞的杀伤能力无影响（图4H）。此外，该抗体显著提高了表达Klra9的小鼠脾脏来源扩增NK细胞对黑色素瘤B16-F10细胞的细胞毒性（图4I）。这些结果共同证明，IGSF8.06抗体通过阻断IGSF8与其NK细胞受体的相互作用来增强NK细胞对恶性细胞的杀伤能力。

▲图4 Development of an anti-IGSF8 antibody to activate NK cell-mediated cytotoxicity

Section.05

抗IGSF8抗体在体内展现出显著的抗肿瘤效果

研究人员在B16-F10同源肿瘤模型中评估了Fc沉默型IGSF8.06抗体的体内疗效，发现使用抗体后肿瘤增长受到显著抑制 (图5A)。对肿瘤浸润CD45+细胞的流式分析显示，IGSF8.06治疗显著增加了NK细胞、T细胞和树突状细胞（DC）的浸润，但对巨噬细胞影响甚微（图5B）。进一步研究发现，虽然使用抗CD4或CD8b抗体清除CD4/CD8 T细胞仅适度影响IGSF8.06抗体的体内疗效（图5C），但用抗NK1.1抗体清除NK细胞则完全消除了其治疗效果（图5D）。由于该抗体在小鼠体内不具备Fc介导的效应功能,这些结果表明IGSF8.06抗体通过阻断作用激活NK细胞是其产生体内抗肿瘤活性的关键机制。我们进一步评估了IGSF8.06抗体作为单药或联合抗PD1治疗在黑色素瘤（B16-F10）、Lewis肺癌（LLC）、结肠癌（CT26）和三阴性乳腺癌（EMT6）同源肿瘤模型中的体内疗效。在所有模型中，IGSF8.06单药治疗均展现出显著的体内抗肿瘤活性（图5E），并且显著提升小鼠的生存率（图5F）。

▲图5 Igsf8 blockade by IGSF8.06 promotes anti-tumor immunity in vivo

总 结

在这项研究中，研究人员通过CRISPR筛选，发现肿瘤表达的IGSF8通过与人NK细胞上的KIR3DL2受体相互作用来抑制NK细胞功能。阻断IGSF8与NK细胞受体相互作用的抗体可增强NK细胞杀伤功能。在小鼠肿瘤模型中，IGSF8.06单药或与抗PD-1联合治疗均展现出显著的体内抗肿瘤活性。研究结果表明，IGSF8是一种先天免疫检查点和潜在的肿瘤治疗靶点。

尚恩产品引用

【SNPM-H045】人肺癌细胞完全培养基

【SNPM-H136】人结肠癌细胞完全培养基

【SNPM-H066】人肝癌细胞完全培养基