基于C-CRISPR优化的跨物种囊胚互补实现小鼠体内生成大鼠前脑组织
2025-08-27 来源:本站 点击次数:65
场景恐惧 | 吴军/杨辉/周海波/郭帆团队在小鼠体内生成大鼠前脑组织
论文上线截图
这篇发表于《Cell》的研究报道了一种基于C-CRISPR优化的跨物种囊胚互补（IBC）技术，实现了在小鼠体内生成大鼠前脑组织。研究者通过快速筛选候选基因，发现Hesx1基因缺失的小鼠胚胎为大鼠胚胎干细胞（rESCs）提供了发育空位，成功重建了结构和功能正常的异种大鼠前脑。该前脑组织在小鼠宿主体内以小鼠的发育节奏生长，但保持了大鼠特异的转录组特征，显示出细胞自主性和非细胞自主性机制共同调控的复杂发育过程。功能评估包括神经元电生理记录和行为学测试，均表明重建的前脑具备正常神经功能。研究还揭示了发育中期至晚期存在的异种细胞竞争和排斥障碍，提示未来需克服这些屏障以提高异种嵌合效率。该工作不仅首次实现了脑组织的跨物种囊胚互补，开辟了利用异种胚胎干细胞研究脑发育、认知功能及进化机制的新途径，也为解决器官移植供体短缺提供了潜在技术平台。
1.CCBC技术通过高效敲除Hesx1基因成功构建前脑发育缺陷模型，并实现90%以上的前脑组织重建效率
作者首先系统性地展示了基于C-CRISPR的囊胚互补技术（CCBC）在器官再生研究中的应用。如图1A左所示，研究者将C-CRISPR技术与传统囊胚互补技术相结合，开发出CCBC这一创新方法，该方法能快速筛选候选基因并一步生成基因敲除动物。在概念验证阶段（图1A右），研究者针对7个Wnt/β-catenin信号通路关键基因进行筛选。基因编辑效率验证显示（图1B），所有候选基因均可被高效敲除，其中Dkk1、Hesx1和Six3的敲除导致显著的前脑发育缺陷（图1C,D）。进一步的嵌合体实验证实（图1E,F），在Dkk1−/−和Hesx1−/−胚胎中注射mESCs可成功重建完整异源前脑，其中Hesx1−/−嵌合体表现出97.06%的高效前脑重构率（图1H,I）；而Six3−/−胚胎则无法被供体细胞挽救（图1E,F）。在新生嵌合体分析中（图1G），Dkk1−/−+mESCs组获得55只（90.16%）成功重建前脑的个体，进一步证实了该技术的可靠性。这些结果不仅验证了CCBC技术的高效性，更揭示了不同基因在前脑发育中的特异性作用，为复杂器官的再生研究提供了重要技术平台和理论依据。
2. Hesx1敲除背景下小鼠前脑的种内胚胎干细胞补偿
接下来，作者通过将tdTomato+ mESCs注入Hesx1−/−（由CAG启动子驱动EGFP表达）囊胚，成功构建了EGFP-tdTomato双标记嵌合体（图2A-B）。在Hesx1−/−+mESCs嵌合体中，前脑（大脑皮层和海马区）几乎全部（~100%）由供体来源的tdTomato+细胞构成，显著高于WT+mESCs嵌合体的~50%（图2C-2E）；而中脑嵌合率仍维持在约50%（图2E），表明Hesx1缺失导致的前脑生态位空缺可被供体细胞完全填补。所有嵌合小鼠均存活至成年，且脑部大小与对照组无差异（图2F-2H）。以上结果证明Hesx1缺失可特异性实现小鼠前脑的高效供体细胞嵌合，为种内前脑互补提供了概念验证。
图2.Hesx1−/−小鼠前脑的种内囊胚互补
3.小鼠内IBC介导的大鼠前脑构建
其次，作者通过CCBC生成rESC衍生前脑组织（图3A）。图3B为WT+rESCs和Hesx1/+rESCs嵌合体在P3和20个月时的代表性图像。在Hesx1−/−嵌合体中，大鼠来源的tdTomato+细胞在皮层和海马区占比更高（图3C-3E）。功能实验证实，rESCs衍生的神经元能形成完整的轴突投射通路：从前外侧运动皮层（ALM）投射至丘脑、上丘和延髓等靶区（图3F），且投射纤维同时表达EGFP和tdTomato双标记信号（图3G）。电生理实验表明，嵌合体中的大鼠和小鼠皮层神经元均能产生正常的动作电位（图3H-3K），且两者的输入阻抗（图3L）、静息膜电位（图3M）及阈值电流（图3N）均无显著差异。综上，Hesx1−/− rESCs能高效生成前脑组织并整合到宿主神经环路中，其衍生的神经元具有正常的电生理特性和长距离投射能力。
图3.通过IBC在小鼠中生成大鼠前脑组织
4. 跨物种嵌合体与同物种嵌合体中，重建的前脑均具备正常的结构和功能
Hesx1−/−+rESCs嵌合体与WT+mESCs及Hesx1−/−+mESCs嵌合体的体重增长曲线相似（图4A），且三组嵌合体的大脑皮层V区及海马区均表达神经标记CTIP2，皮层厚度与细胞密度无显著差异（图4B–4E）。行为学测试（Morris水迷宫、旷场实验及恐惧条件反射）进一步表明，各组嵌合体的认知功能均正常（图4F–4H）。综上，种间嵌合体重构的前脑在结构与功能上均发育正常。
图4.种内或种间嵌合体重构的前脑在结构和功能上均表现正常
5. 发育中晚期的异种屏障
在Hesx1−/−+rESCs嵌合体发育过程中，随着胚胎生长，大鼠细胞在小鼠胎儿中的整体嵌合率从约60%逐渐下降至E17.5时的20%，而前脑区域的嵌合水平也从早期的90%-100%显著降低至E15.5时的约60%（图5A–5C）。这些数据表明，大鼠和小鼠之间存在妊娠中晚期的种间屏障，导致嵌合效率下降。以上结果表明异种嵌合体在发育中晚期面临显著的种间限制，需进一步优化方法以提高嵌合率。
图5.Hesx1−/−+rESCs嵌合体中供体大鼠细胞的动态贡献
6. 大鼠-小鼠嵌合前脑重构中的细胞自主与非自主作用
Hesx1−/−+rESCs（大鼠-小鼠嵌合体）胚胎的脑发育速率与野生型小鼠及Hesx1−/−+mESCs（小鼠-小鼠嵌合体）一致（图6A），表明嵌合体内大鼠脑组织的发育与小鼠宿主同步。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图6B-6D）发现，rESC在嵌合前脑中分化为兴奋性神经元（EXs）、抑制性神经元（INs）等多种细胞类型（图6E），且其转录组特征与野生型大鼠神经元相似，而宿主Hesx1−/−小鼠神经元则保持小鼠特征（图6F、6G）。差异基因分析（图6H）显示，部分基因在轴突发生、前脑发育等通路中富集（图6I、6J）。以上结果表明嵌合体内大鼠神经元的发育和转录组特征主要由细胞自主性机制调控，同时受宿主微环境部分影响。
图6.前脑重建型大鼠-小鼠嵌合体中的细胞自主性与非细胞自主性效应
SA218 场景恐惧系统
场景恐惧实验系统（FCS）用于小型啮齿类动物（大、小鼠）环境相关条件性恐惧实验研究。啮齿类动物在恐惧时会表现出特有的不动状态（immobility），动物在这种情况下倾向于保持静止不动的防御姿势。抗抑郁药和抗中枢兴奋药可以明显缩短不动状态持续的时间。
实验过程中，实验对象被给与一个声音信号（条件刺激），随后给予电击（非条件）刺激。该训练称为条件性训练，训练结束后实验动物进行声音信号或环境联系性实验。一般情况下啮齿类动物对相应的环境和不同环境下同样的声音信号都会做出明显的条件性恐惧反应，如静止不动。这种测试可以在训练结束后立刻或几天后进行可以提供在条件信号影响下短期和长期记忆的信息。
SA201 Morris水迷宫
Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）实验是一种强迫实验动物（大鼠、小鼠）游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感（空间定位）的学习记忆能力。被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马/外海马研究、智力与衰老、新药开发/筛选/评价、药理学、毒理学、预防医学、神经生物学、动物心理学及行为生物学等多个学科的科学研究和计算机辅助教学等领域。
SA215 旷场视频分析系统
旷场实验视频分析系统（open field test）是观察研究实验动物神经精神变化、进入开阔环境后的各种行为，例如动物对新开阔环境的恐惧而主要在周边区域活动，在中央区域活动较少，但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机，也可观察由此而产生的焦虑心理。中枢兴奋药物可以明显增加自主的活动而减少探究行为，一定剂量的抗精神病药物可以减少探究行为而不影响自主活动。
论文上线截图
这篇发表于《Cell》的研究报道了一种基于C-CRISPR优化的跨物种囊胚互补（IBC）技术，实现了在小鼠体内生成大鼠前脑组织。研究者通过快速筛选候选基因，发现Hesx1基因缺失的小鼠胚胎为大鼠胚胎干细胞（rESCs）提供了发育空位，成功重建了结构和功能正常的异种大鼠前脑。该前脑组织在小鼠宿主体内以小鼠的发育节奏生长，但保持了大鼠特异的转录组特征，显示出细胞自主性和非细胞自主性机制共同调控的复杂发育过程。功能评估包括神经元电生理记录和行为学测试，均表明重建的前脑具备正常神经功能。研究还揭示了发育中期至晚期存在的异种细胞竞争和排斥障碍，提示未来需克服这些屏障以提高异种嵌合效率。该工作不仅首次实现了脑组织的跨物种囊胚互补，开辟了利用异种胚胎干细胞研究脑发育、认知功能及进化机制的新途径，也为解决器官移植供体短缺提供了潜在技术平台。
1.CCBC技术通过高效敲除Hesx1基因成功构建前脑发育缺陷模型，并实现90%以上的前脑组织重建效率
作者首先系统性地展示了基于C-CRISPR的囊胚互补技术（CCBC）在器官再生研究中的应用。如图1A左所示，研究者将C-CRISPR技术与传统囊胚互补技术相结合，开发出CCBC这一创新方法，该方法能快速筛选候选基因并一步生成基因敲除动物。在概念验证阶段（图1A右），研究者针对7个Wnt/β-catenin信号通路关键基因进行筛选。基因编辑效率验证显示（图1B），所有候选基因均可被高效敲除，其中Dkk1、Hesx1和Six3的敲除导致显著的前脑发育缺陷（图1C,D）。进一步的嵌合体实验证实（图1E,F），在Dkk1−/−和Hesx1−/−胚胎中注射mESCs可成功重建完整异源前脑，其中Hesx1−/−嵌合体表现出97.06%的高效前脑重构率（图1H,I）；而Six3−/−胚胎则无法被供体细胞挽救（图1E,F）。在新生嵌合体分析中（图1G），Dkk1−/−+mESCs组获得55只（90.16%）成功重建前脑的个体，进一步证实了该技术的可靠性。这些结果不仅验证了CCBC技术的高效性，更揭示了不同基因在前脑发育中的特异性作用，为复杂器官的再生研究提供了重要技术平台和理论依据。
图1.CCBC技术为神经囊胚互补提供了快速遗传筛选方案
2. Hesx1敲除背景下小鼠前脑的种内胚胎干细胞补偿
接下来，作者通过将tdTomato+ mESCs注入Hesx1−/−（由CAG启动子驱动EGFP表达）囊胚，成功构建了EGFP-tdTomato双标记嵌合体（图2A-B）。在Hesx1−/−+mESCs嵌合体中，前脑（大脑皮层和海马区）几乎全部（~100%）由供体来源的tdTomato+细胞构成，显著高于WT+mESCs嵌合体的~50%（图2C-2E）；而中脑嵌合率仍维持在约50%（图2E），表明Hesx1缺失导致的前脑生态位空缺可被供体细胞完全填补。所有嵌合小鼠均存活至成年，且脑部大小与对照组无差异（图2F-2H）。以上结果证明Hesx1缺失可特异性实现小鼠前脑的高效供体细胞嵌合，为种内前脑互补提供了概念验证。
图2.Hesx1−/−小鼠前脑的种内囊胚互补
3.小鼠内IBC介导的大鼠前脑构建
其次，作者通过CCBC生成rESC衍生前脑组织（图3A）。图3B为WT+rESCs和Hesx1/+rESCs嵌合体在P3和20个月时的代表性图像。在Hesx1−/−嵌合体中，大鼠来源的tdTomato+细胞在皮层和海马区占比更高（图3C-3E）。功能实验证实，rESCs衍生的神经元能形成完整的轴突投射通路：从前外侧运动皮层（ALM）投射至丘脑、上丘和延髓等靶区（图3F），且投射纤维同时表达EGFP和tdTomato双标记信号（图3G）。电生理实验表明，嵌合体中的大鼠和小鼠皮层神经元均能产生正常的动作电位（图3H-3K），且两者的输入阻抗（图3L）、静息膜电位（图3M）及阈值电流（图3N）均无显著差异。综上，Hesx1−/− rESCs能高效生成前脑组织并整合到宿主神经环路中，其衍生的神经元具有正常的电生理特性和长距离投射能力。
图3.通过IBC在小鼠中生成大鼠前脑组织
4. 跨物种嵌合体与同物种嵌合体中，重建的前脑均具备正常的结构和功能
Hesx1−/−+rESCs嵌合体与WT+mESCs及Hesx1−/−+mESCs嵌合体的体重增长曲线相似（图4A），且三组嵌合体的大脑皮层V区及海马区均表达神经标记CTIP2，皮层厚度与细胞密度无显著差异（图4B–4E）。行为学测试（Morris水迷宫、旷场实验及恐惧条件反射）进一步表明，各组嵌合体的认知功能均正常（图4F–4H）。综上，种间嵌合体重构的前脑在结构与功能上均发育正常。
图4.种内或种间嵌合体重构的前脑在结构和功能上均表现正常
5. 发育中晚期的异种屏障
在Hesx1−/−+rESCs嵌合体发育过程中，随着胚胎生长，大鼠细胞在小鼠胎儿中的整体嵌合率从约60%逐渐下降至E17.5时的20%，而前脑区域的嵌合水平也从早期的90%-100%显著降低至E15.5时的约60%（图5A–5C）。这些数据表明，大鼠和小鼠之间存在妊娠中晚期的种间屏障，导致嵌合效率下降。以上结果表明异种嵌合体在发育中晚期面临显著的种间限制，需进一步优化方法以提高嵌合率。
图5.Hesx1−/−+rESCs嵌合体中供体大鼠细胞的动态贡献
6. 大鼠-小鼠嵌合前脑重构中的细胞自主与非自主作用
Hesx1−/−+rESCs（大鼠-小鼠嵌合体）胚胎的脑发育速率与野生型小鼠及Hesx1−/−+mESCs（小鼠-小鼠嵌合体）一致（图6A），表明嵌合体内大鼠脑组织的发育与小鼠宿主同步。单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图6B-6D）发现，rESC在嵌合前脑中分化为兴奋性神经元（EXs）、抑制性神经元（INs）等多种细胞类型（图6E），且其转录组特征与野生型大鼠神经元相似，而宿主Hesx1−/−小鼠神经元则保持小鼠特征（图6F、6G）。差异基因分析（图6H）显示，部分基因在轴突发生、前脑发育等通路中富集（图6I、6J）。以上结果表明嵌合体内大鼠神经元的发育和转录组特征主要由细胞自主性机制调控，同时受宿主微环境部分影响。
图6.前脑重建型大鼠-小鼠嵌合体中的细胞自主性与非细胞自主性效应
SA218 场景恐惧系统
实验过程中，实验对象被给与一个声音信号（条件刺激），随后给予电击（非条件）刺激。该训练称为条件性训练，训练结束后实验动物进行声音信号或环境联系性实验。一般情况下啮齿类动物对相应的环境和不同环境下同样的声音信号都会做出明显的条件性恐惧反应，如静止不动。这种测试可以在训练结束后立刻或几天后进行可以提供在条件信号影响下短期和长期记忆的信息。
SA201 Morris水迷宫
Morris水迷宫（Morris water maze, MWM）实验是一种强迫实验动物（大鼠、小鼠）游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感（空间定位）的学习记忆能力。被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马/外海马研究、智力与衰老、新药开发/筛选/评价、药理学、毒理学、预防医学、神经生物学、动物心理学及行为生物学等多个学科的科学研究和计算机辅助教学等领域。
SA215 旷场视频分析系统
相关文章
更多 >