Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis

Keywords: OSS; PSS; Autophagy ; Autophagic flux; Mitochondrial homeostasis.

自噬是一种进化保守且受严格调控的细胞过程，通过降解蛋白质、细胞器等成分维持细胞功能，其调控与 ATG 基因激活相关，ULK-Atg17 复合物、mTOR 等参与其中，ATG8/LC3 家族、ATG5 在自噬体形成中起关键作用，p62 积累是自噬流受损的标志。自噬功能失调与心血管疾病等多种病理状态相关，而氧化应激是自噬的主要诱导因素，ox-LDL 等可诱导自噬并伴随 mtDNA 损伤，线粒体因缺乏组蛋白保护易受氧化应激影响。

剪切应力对血管内皮细胞有代谢和机械双重作用，与动脉粥样硬化的局灶性相关。动脉分叉处血流模式复杂，侧壁的振荡剪切应力（OSS）会诱导氧化应激，通过激活 NADPH 氧化酶和 JNK 导致线粒体超氧化物增加、mtDNA 损伤等；中壁的脉动剪切应力（PSS）则下调炎症和氧化应激。研究表明，OSS 可诱导自噬但损伤自噬流，促进线粒体功能障碍等；PSS 则情况相反，而剪切应力的空间和时间变化在很大程度上决定了血管氧化应激和促炎状态的局灶性，不过血流剪切应力与自噬之间的机械转导机制仍不明确。

基于此，美国加州大学洛杉矶分校戴维・格芬医学院内科学系的研究团队通过研究剪切应力的时间和空间变化与血管代谢效应的关系，发现OSS 损伤自噬流，从而干扰线粒体稳态。 研究结果发表在Antioxidants & redox signaling期刊，题为“Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis”。

首先，为了探究剪切应力空间变化与自噬的关系，研究通过计算流体动力学展示了收缩期和舒张期某一瞬时的 兔主动脉壁面剪切应力的空间变化（∂τ/∂x）和时间变化（∂τ/∂t）（图 1A） ，并对主动脉弓（暴露于 OSS）和降主动脉（暴露于PSS）进行 p62 免疫染色。结果显示，在暴露于OSS 的主动脉弓的内皮细胞 p62 染色显著（图 1B） ，而在暴露于 PSS 的降主动脉中，p62 染色几乎不存在（图 1C）。结果表明 剪切应力的空间变化与 p62 染色相关，也为研究剪切应力时间变化（PSS 与 OSS） 是否差异诱导自噬奠定了基础。

图1   剪切应力的空间变化差异性增加兔主动脉中 p62 的积累。

接着，为了探究剪切应力时间变化（PSS 与 OSS）对自噬的影响，研究将人主动脉内皮细胞分别暴露于两种应力中 4 小时。结果显示，OSS 使 LC3-II/LC3-I 比值显著升高（较静态组增 120%，较 PSS 组增 77%），并使 p62 水平增加 37%（图 2A），同时OSS 显著促进通过 Earle's 平衡盐溶液（EBSS）诱导的饥饿性自噬也能增加自噬体形成 （图2B）；而 PSS 仅轻微提高 LC3 比值（23%），对 p62 水平和自噬体形成无显著影响（图 2A与图 2B）。此外，饥饿诱导的自噬也会增加自噬体标记物（图 2B）。这些结果表明 OSS 能显著诱导自噬。

为了进一步明确 OSS 对自噬流的调节，研究人员比较了在自溶酶体抑制剂巴佛洛霉素存在时的 LC3 比值和 p62 水平。结果显示，EBSS 诱导自噬时 LC3 比值升高、p62 降低，而 EBSS 与巴佛洛霉素联合处理则使两者均进一步升高（图 2C）。OSS 与巴佛洛霉素联合处理也使 LC3 比值和 p62 水平较单独 OSS 组升高（图 2C）。这表明 OSS 虽能通过增加 LC3-II/LC3-I 比值诱导自噬，但会因 p62 水平升高而损伤自噬流，导致自噬过程不完整。

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图2   剪切应力的时间变化（OSS vs. PSS ）差异性诱导HAECs 的自噬。

已有研究表明 OSS 可通过激活 NADPH 氧化酶和 JNK 信号通路诱导内皮细胞产生超氧化物。研究人员通过转染 MnSOD 腺病毒减少线粒体超氧化物，结果显示，MnSOD 过表达显著降低了 OSS 诱导的 LC3-II/LC3-I 比值（与静态条件相比，p<0.05，n=4）（图 3A）。 使用抗氧化剂 NAC、JNK 抑制剂 SP600125 处理人主动脉内皮细胞，均显著降低了 OSS 诱导的 LC3-II/LC3-I 比值（图 3B、C）。这表明，OSS 通过介导超氧化物产生和 JNK 磷酸化来诱导自噬。

图3   OSS 诱导的氧化应激及 JNK 激活可激活自噬。

进一步研究发现，OSS 会显著增加人主动脉内皮细胞的线粒体超氧化物（mtO₂・⁻）产生（图 4A）。而 EBSS 可减轻 OSS 对自噬流的抑制并减少 mtO₂・⁻产生（图 4A）。雷帕霉素处理也有类似效果；反之，用 siRNA 敲低 ATG5 则会增强线粒体超氧化物的荧光强度（图 4B）。这表明，诱导自噬能够减轻 OSS 介导的mtO₂・⁻ 产生。

图4    EBSS 激活的自噬减轻了OSS 诱导的mtO₂・⁻ 产生。

然后研究发现，OSS 会显著降低线粒体呼吸（降幅 46%），EBSS 诱导的自噬逆转了 OSS 介导的线粒体呼吸降低（图 5A）。OSS 会显著降低线粒体复合体 II 活性（降幅 43%），而 而 EBSS 可恢复该活性（图 5B）。雷帕霉素诱导的自噬也能恢复 OSS 降低的复合体 II 活性。这表明，自噬的诱导可恢复线粒体呼吸功能。

图5   EBSS 激活的自噬恢复了OSS 介导的线粒体呼吸降低。

mtDNA 因不与组蛋白结合而易受氧化损伤。研究发现，OSS 可诱导 mtDNA 损伤（表现为 8-OHdG 积累且与线粒体共定位）（图 6A）。OSS 使 mtDNA 损伤增加 4.5 倍（图 6B），而对核 DNA 损伤无显著影响（图 6C）。进一步实验显示，过表达 MnSOD、使用抗氧化剂NAC 或 JNK 抑制剂 SP600125，均能显著减轻 OSS 诱导的 mtDNA 损伤（图 7A-7C） 。这表明，OSS 通过诱导 mtO₂・⁻产生和激活 JNK 信号通路来促进 mtDNA 损伤。

图6   OSS 诱导线粒体 DNA损伤。

图7   抗氧化剂和 JNK 抑制剂可逆转OSS 诱导的线粒体 DNA损伤。

最后，为了在体内研究 OSS 诱导的 JNK 激活和 mtDNA 损伤的空间变化，研究对新西兰白兔的主动脉弓和降主动脉进行免疫染色，发现主动脉弓中氧化 DNA 损伤标志物 8-OHdG 和磷酸化 JNK 的染色显著，而降主动脉中几乎无染色（图 8）。这表明剪切应力的空间变化（如主动脉弓的不同弯曲部位与降主动脉之间）和时间变化（OSS 与 PSS）会差异性地诱导自噬和自噬流（图 1），从而调节线粒体稳态（图 6）。

图8   剪切应力的空间变化差异性地促进新西兰白兔的 DNA 损伤和 JNK 激活。

图9   OSS 调控自噬的机制示意图。

总之，血流剪切应力的空间和时间变化会调节内皮细胞代谢状态，与动脉粥样硬化病变的局灶性和偏心性相关。虽流体剪切应力与氧化应激的机械转导机制已明确，但研究进一步揭示了紊乱血流的新代谢作用：一是通过影响 LC3-II/LC3-I 比值促进自噬体生成，二是通过 p62 积累损伤自噬流。同时，还阐明了 OSS 介导的氧化应激和 JNK 信号通路在激活自噬、调节线粒体稳态中的作用（图 9）。

参考文献：Li R, Jen N, Wu L, Lee J, Fang K, Quigley K, Lee K, Wang S, Zhou B, Vergnes L, Chen YR, Li Z, Reue K, Ann DK, Hsiai TK. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxid Redox Signal. 2015 Nov 20;23(15):1207-19. doi: 10.1089/ars.2014.5896. Epub 2015 Jun 29. PMID: 26120766; PMCID: PMC4657520.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26120766/
Impact Factor: 6.1
ISSN: 1523-0864 (Print); 1557-7716 (Electronic) 

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