文章来源公众号：Chestnut Studying 作者：Chestnut

摘要
Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is a promising immunotherapy against cancer. Although there is a growing interest in other cell types, a comparison of CAR immune effector cells in challenging solid tumor contexts is lacking. Here, we compare mouse and human NKG2D-CAR-expressing T cells, natural killer (NK) cells, and macrophages against glioblastoma, the most aggressive primary brain tumor. In vitro we show that T cell cancer killing is CAR dependent, whereas intrinsic cytotoxicity overrules CAR dependence for NK cells, and CAR macrophages reduce glioma cells in co-culture assays. In orthotopic immunocompetent glioma mouse models, systemically administered CAR T cells demonstrate superior accumulation in the tumor, and each immune cell type induces distinct changes in the tumor microenvironment. An otherwise low therapeutic efficacy is significantly enhanced by co-expression of pro-inflammatory cytokines in all CAR immune effector cells, underscoring the necessity for multifaceted cell engineering strategies to overcome the immunosuppressive solid tumor microenvironment.

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是治疗癌症极具前景的免疫疗法。尽管其他细胞类型的研究日益受到关注，但在复杂实体瘤环境中对CAR免疫效应细胞的比较研究仍显不足。本研究通过小鼠与人类NKG2D-CAR表达T细胞、自然杀伤（NK）细胞及巨噬细胞对抗最具侵袭性的原发性脑肿瘤——胶质母细胞瘤，进行了系统比较。体外实验表明：T细胞的抗癌杀伤能力依赖于CAR，而NK细胞的固有细胞毒性则超越了CAR依赖性；在共培养实验中，CAR巨噬细胞可减少胶质瘤细胞。在原位免疫功能正常胶质瘤小鼠模型中，全身给药的CAR T细胞在肿瘤组织中呈现显著富集，且每种免疫细胞类型均诱导肿瘤微环境发生独特改变。通过在所有CAR免疫效应细胞中共表达促炎性细胞因子，显著提升了原本较低的治疗效果，这强调了采用多维细胞工程策略克服免疫抑制性实体瘤微环境的必要性。



实验结果1
利用 mRNA 转染技术可高效生成小鼠 CAR T 细胞、CAR NK 细胞和 CAR 巨噬细胞，并在体外显示出不同的抗肿瘤活性

为了对小鼠 NKG2DCAR免疫效应细胞在同种异体正位免疫功能设置中的功能进行比较，关键是要生成足够数量的小鼠免疫细胞，并确定一种可在每种细胞类型中进行可比CAR表达的系统。为了扩增原代免疫细胞亚群，作者采用了最近建立的小鼠 T 细胞、NK 细胞和骨髓来源巨噬细胞扩增方案，产生了足够的细胞用于体内收养性细胞转移（图 1A）。作者设计了表达 NKG2DCAR和报告蛋白 RQR8 的 mRNA、逆转录病毒载体和睡美人（SB）系统，它们通过 Furin/T2A 裂解位点分离。在Naive NKG2D 阳性的 T 细胞和NK 细胞中共同表达 RQR8 以量化转染和转导效率。在所有细胞类型中，只有 mRNA电穿孔显示出高效和可比的转染效率，且不妨碍细胞增殖。即使是慢病毒转导也没有提高 NK 细胞的转染效率。

因此，mRNA转染被证明是交叉比较不同CAR效应细胞的最佳系统。为了确定 mRNA 的表达动力学，作者生成了编码荧光蛋白 ZsGreen 的 mRNA。流式细胞术显示，用 ZsGreen mRNA电穿孔对所有免疫细胞类型的转染效率几乎达到 100%，而且在长达 5 天的时间里，80% 以上的细胞都能检测到 ZsGreen（图 1B-1D）。ZsGreen 的表达用显微镜进行了确认，从转染后 2 小时开始，根据细胞类型的不同，在 7-12 小时后达到高峰（图 1E）。除了编码NKG2D-Furin/T2A-RQR8（CAR）的mRNA外，作者还设计了一个只编码NKG2D肿瘤结合结构域而不编码细胞内CD3ζ结构域的功能对照（CARΔ(CD3ζ)）（图1F）。

为了在体外评估不同CAR 免疫效应细胞的抗肿瘤潜力，作者用编码 ZsGreen 的 mRNA 和编码 CAR 或对照 CARΔ(CD3ζ) 的 mRNA 共同转染它们，将它们与表达 tdTomato- 的 GL-261 细胞共同培养，并随时间推移量化肿瘤汇合度。只有CAR T细胞能降低肿瘤细胞的汇合度，而与仅肿瘤细胞相比，CARΔ(CD3ζ) T细胞或模拟转染的T细胞则没有任何影响（图1G）。NK 细胞介导的杀伤与CAR 表达无关，并显示出快速动力学，共培养 8 小时后胶质瘤细胞几乎被完全消灭（图 1H ）。表达 CAR 后，NK 细胞的杀伤力没有提高，这让作者不禁要问，这是 CAR 设计的原因，还是体外培养条件过度激活了 NK 细胞。作者用靶向淋巴瘤细胞CD19的第二代CD28-CD3ζ CAR 转染 NK 细胞，对这一问题进行了研究。CD19CAR 的表达对靶细胞杀伤力的改善不大，而对 T 细胞的杀伤力则大幅提高。

这表明，其他 CAR 设计可能会增加 NK 细胞对胶质瘤细胞的杀伤力。然而，在免疫抑制条件下，NKG2D表面表达下调，模拟转染的 NK 细胞抗肿瘤活性降低，但 NKG2D CAR 表达保留了 NK 细胞的功能，证明了其功能益处。这促使作者在研究中继续使用 NKG2D CAR。当表达 CAR 或 CARΔ(CD3ζ)时，巨噬细胞会随着时间的推移降低肿瘤细胞的汇合度，但不会控制肿瘤生长（图 1I）。巨噬细胞上 CAR 的表达有利于CD86的表达，CD86是一种已知的促炎巨噬细胞表型标记。与三种不同的胶质瘤细胞系和两种脑转移细胞系共培养的流式细胞术证实了这些发现，并表明巨噬细胞减少了肿瘤细胞数量，但没有使肿瘤细胞溶解（图 1J、1 K）。主要组织相容性复合体I 类（MHC I 类）分子而非 NKG2D 配体 Rae-1 的表面表达与 NK 细胞介导的细胞系杀伤成反比。

实验结果2
CAR T 细胞在体内肿瘤中的蓄积能力更强

为了评估全身给药的 CAR T 细胞、CAR NK 细胞和 CAR 巨噬细胞在正位、合成实体瘤环境中的肿瘤归巢特性，作者使用体外三维显微镜观察了 GL-261 胶质瘤小鼠脑内静脉给药荧光标记的 NKG2DCAR 免疫效应细胞的数量和空间分布。所有类型的被收养转移的CAR免疫效应细胞主要位于高度血管化的肿瘤肿块内，而不是周围的脑实质内（图2A）。

与随机模拟相比，对累积的 CAR 免疫效应细胞分布进行的详细空间分析表明，CAR T 细胞（而非 CAR NK 细胞和 CAR 巨噬细胞）倾向于靠近血管结构（图 2B-2D）。每种处理后，每个肿瘤的相对血管体积相当。值得注意的是，CAR T 细胞和 NK 细胞均匀地分布在肿瘤的所有区域，而 CAR 巨噬细胞则聚集成团，肿瘤外围区域几乎没有（图 2E）。在不同的效应细胞中，CAR T 细胞的数量比 CAR NK 细胞或 CAR 巨噬细胞多（图 2F）。为了证实三维显微镜分析，作者将转染了 NKG2D CAR mRNA 的 CD45.1+ 免疫细胞静脉注射到 CD45.2+患胶质瘤的小鼠体内，并使用体外流式细胞仪量化了肿瘤浸润细胞的数量。

结果证实，CAR T 细胞比 CAR NK 细胞或 CAR 巨噬细胞数量更多（图 2G）。由于细胞数量较少，作者还研究了局部瘤内注射作为一种替代给药途径。与全身注射相比，这大大增加了所有 CAR 免疫效应细胞的瘤内数量。瘤内注射两天后，CAR T 细胞和 CAR 巨噬细胞在肿瘤内的存活率很高，而 CAR NK 细胞的存活率较低（图 2H）。总之，这些结果表明，CAR T 细胞在静脉给药后具有最佳的肿瘤归巢潜能，但一般来说，局部给药途径更适合将足够的 CAR 效应细胞送到肿瘤部位。

实验结果3
scRNA-seq鉴定肿瘤微环境中CAR T细胞、CAR NK细胞和CAR巨噬细胞疗法的不同免疫特征

为了描述不同CAR效应细胞对肿瘤微环境的影响，作者在GL-261胶质瘤小鼠体内注射了CD45.1+ CAR T细胞、CAR NK细胞或CAR巨噬细胞，并在治疗5天后使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了CD45.2+肿瘤浸润免疫细胞的分布情况。作者评估了通过质量控制的每个样本至少n= 6,499 个白细胞的单细胞 RNA图谱。作者使用均匀流形近似和投影（UMAP）技术对结果中的n= 33,345 个细胞进行了可视化处理。

胶质母细胞瘤中肿瘤浸润免疫细胞的分布包括不同的髓系细胞群，包括单核细胞、一大群肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和小胶质细胞（图 3A）。此外，作者还检测到粒细胞、树突状细胞、NK 细胞、T 细胞和 B 细胞。不同的 CAR 免疫效应细胞导致了肿瘤免疫微环境的个体极化。CAR T细胞治疗与更多的TAMs和粒细胞明显相关。CAR NK细胞和CAR巨噬细胞的处理分别与更多的过渡性单核细胞或TAMs和NK细胞有关（图3B和3C）。

T 细胞集群以及由单核细胞和 TAMs 组成的髓系细胞集群的基因本体富集分析进一步证实了这些不同的效应（图 3D 和 3E）。CAR T细胞处理导致T细胞集群向细胞毒性状态转变，而对髓系细胞群的影响主要体现在代谢方面，并以糖酵解转录程序的变化为特征。CAR NK细胞和CAR巨噬细胞诱导了与抗病毒免疫防御相关的本体术语（图3D）。CAR NK细胞和CAR巨噬细胞处理后，髓系细胞也出现了向抗病毒免疫反应的转变（图3E）。然而，对于 CAR 巨噬细胞来说，它似乎不是细胞自主的，而是通过 NK 细胞驱动的。

接下来，作者进一步分析了CAR免疫效应细胞处理对髓系细胞的不同影响，髓系细胞是胶质瘤肿瘤微环境中最大的免疫细胞亚群。为此，作者以经典的Ly6chi单核细胞群作为最早的时间点进行了伪时间分析（图 3F）。在已确定的转录连续体中，过渡性单核细胞之后是小胶质细胞相关转录程序表达量不断增加的 TAMs。对六个新兴基因模块中明显富集基因的分析表明，早期 “伪 ”时间点与伤口愈合和抗病毒反应术语相关。中期时间点的特征是抗原处理相关基因和向巨噬细胞迁移过渡；晚期时间点则显示脂质代谢状态（图 3G）。各阶段的丰度分析表明，对照组富集了中期和晚期阶段相关基因表达模块（图 3H）。

同样，CAR T 细胞治疗与中期和晚期相关模块 2 和 4 相关，而 CAR NK 细胞治疗与早期和中期相关模块 1、3 和 6 显著相关。CAR 巨噬细胞治疗显示出模糊的特征，富集于早期阶段模块 3（与 CAR NK 细胞一起）和晚期阶段模块 4（与 CAR T 细胞一起）。总之，CAR T 细胞处理与髓系细胞的代谢重编程和晚期 TAMs 的出现有关，而 CAR NK 细胞处理则增加了过渡性单核细胞的丰度以及 T 细胞和髓系细胞的抗病毒反应。CAR 巨噬细胞处理显示了两者的特征。

实验结果4
通过同时表达促炎细胞因子，可将 CAR 免疫效应细胞治疗的有限生存益处转化为治疗效果

接下来，作者比较了不同 CAR 免疫效应细胞在体内的治疗潜力。为此，作者使用了完全免疫功能健全的合成胶质瘤小鼠模型，并在肿瘤内给予 CAR T 细胞、CAR NK 细胞或 CAR 巨噬细胞（图 4A）。用模拟转染的T细胞、NK细胞或巨噬细胞治疗对小鼠的总体存活率影响有限，但没有长期存活的小鼠（图4B和4 C）。在所有 CAR 免疫效应细胞中，CAR T 细胞的表现最好。

然而，总体抗肿瘤活性仍然有限，GL-261 肿瘤小鼠只有一只长期存活，SB-28 肿瘤小鼠的中位存活率也只有提高，没有长期存活（图 4D 和 4E）。CAR T 细胞治疗还伴随着治疗后两天肿瘤内最强的干扰素（IFN）γ 释放，而血浆中的 IFNγ 浓度仍低于检测限（图 4F）。边际存活效应与治疗过程中 CAR细胞存活率的下降无关。术后存活的 CAR 免疫效应细胞保持了很高的存活率，并保留了体外抗肿瘤活性。每种 CAR 免疫效应细胞的各自优势促使人们探索它们的联合用药是否能在体内产生协同效应。然而，事实并非如此，CAR T细胞、CAR NK细胞和CAR巨噬细胞的联合应用提高了小鼠的中位总存活率，但并没有提高长期存活小鼠的数量（图4G）。为了克服肿瘤微环境的免疫抑制作用，作者最近研究并证明，多功能 CAR T 细胞在转染了编码细胞因子 IL-12 和 IFNα2 的 mRNA 后，也能治愈神经胶质瘤小鼠。

事实上，用每种多功能 CAR 免疫效应细胞治疗都能提高小鼠的总体存活率，其中多功能 CAR NK 细胞表现最佳，能治愈 6 只神经胶质瘤小鼠中的 4 只（图 5A）。即使用只转染了编码细胞因子而没有转染 CAR 的 mRNA 的 T 细胞和 NK 细胞进行治疗，也能提高患胶质瘤小鼠的总体存活率。在携带侵袭性乳腺癌转移细胞株 E0771-BrM 的小鼠中，CAR 免疫效应细胞中共同表达的细胞因子也能提高生存率（图 5B）。在神经胶质瘤小鼠中，细胞因子共表达显示注射五天后 CAR T 细胞和 CAR NK 细胞数量增加。这与瘤内 IFNγ 的长期释放和肿瘤相关髓系细胞的CD86上调有关（图 5C、5 D）。同样，CAR 巨噬细胞上的 CD86 表达也因细胞因子共表达和招募到肿瘤的 CD8α T 细胞数量增加而增加。

总体而言，治疗耐受性良好，作为毒性间接指标的体重在多功能 CAR 和细胞因子表达免疫细胞治疗过程中保持稳定。血值评估显示肌酐值不变，但天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和多功能 CAR 巨噬细胞的 IFNγ 值升高（图 5F）。然而，组织学评估显示，安乐死小鼠的肝脏和脾脏内未出现与多功能 CAR 细胞给药相关的明显形态学变化。

实验结果5
只有 CAR 淋巴细胞在体外和体内对人类胶质母细胞瘤具有活性

最后，作者的目标是确定在小鼠 CAR 效应细胞上观察到的发现是否可以转化为人类 CAR 免疫效应细胞。为此，作者制定了原代人 T 细胞、NK 细胞和巨噬细胞的扩增方案。在确认所有细胞类型的 mRNA 转染效率高达 94% 以上后，作者使用粘附的人胶质瘤细胞系 LN-229 和球形胶质瘤启动细胞系 ZH-161 进行了 24 小时杀伤试验。与小鼠类似，表达 CARΔ（CD3ζ）的人 CAR T 细胞（而非对照组）能有效地裂解这两种细胞系。

与此相反，只有在免疫抑制条件下表达 CAR 才能提高 NK 细胞的杀伤力，而免疫抑制条件会像小鼠一样下调 NKG2D 的表面表达（图 6A）。与小鼠细胞相反，人类 NK 细胞介导的杀伤力与肿瘤细胞表面 MHC I 类分子的表达无关，但与 NKG2D 配体 MHC I 类多肽相关序列 A/B（MICA/B）相关。使用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）从CD14+单核细胞分化出巨噬细胞，或使用促炎细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和 IFNγ 极化巨噬细胞。M-CSF和GM-CSF/IFNγ都分化了CAR巨噬细胞，使胶质瘤细胞减少达30%，而对照组表达CARΔ(CD3ζ)的巨噬细胞减少胶质瘤细胞数量的程度较小（图6B）。

接下来，作者用编码 ZsGreen 的 mRNA 和编码人 NKG2D CAR、人细胞因子（IL-12 和 IFNα2）或 CAR 和细胞因子的 mRNA 共同转染人免疫细胞，并将它们与胶质母细胞瘤患者样本进行体外共同培养。24 小时后，作者使用基于图像的单细胞平台--药理学镜分析了胶质母细胞瘤细胞的数量。总体而言，与 PBS 对照组相比，与人类淋巴细胞共同培养的肿瘤细胞数量明显减少（图 6C）。此外，作者还观察到 CAR T 细胞和共表达细胞因子的 CAR T 细胞的抗胶质母细胞瘤活性有所提高，这表现在肿瘤细胞分数降低和 T 细胞出现集群（图 6C 和 6D）。此外，共同表达 CAR 和细胞因子还能显著提高 NK 细胞对肿瘤细胞的杀伤力。这些结果表明，在杀死胶质母细胞瘤细胞方面，人 CAR 淋巴细胞优于人 CAR 巨噬细胞，而且如果 CAR 淋巴细胞转染后同时表达 IL-12 和 IFNα2，还能带来抗肿瘤益处。