荧光偏振技术研究青霉素与PBP5相互作用，解析抗生素耐药分子机制
2025-09-09 来源:本站 点击次数:45随着抗生素耐药问题日益严峻，深入研究其分子基础显得尤为重要。本研究聚焦于青霉素与青霉素结合蛋白（PBP5）的结合机制，采用荧光偏振技术，探索不同PBP5变异体的结合行为，揭示抗性差异的关键所在。
青霉素与β-内酰胺类抗生素的作用机制
苄青霉素最早发现于 20 世纪 20 年代，此后又有数千种新的青霉素衍生物被发现。青霉素属于β-内酰胺类抗生素²，该类抗生素是目前临床上最常用的一类。新的β-内酰胺类药物不断被开发出来，以扩展其对更多细菌种类的作用范围，或用于对抗耐药机制¹。
β-内酰胺类抗生素通过与细菌细胞壁中的青霉素结合蛋白（PBPs）结合并作用于其功能，从而发挥杀菌作用²。PBPs是一类在细菌细胞壁肽聚糖交联最后步骤中发挥关键作用的酶¹。β-内酰胺类药物通过抑制该交联过程，破坏细菌细胞壁的构建。
细菌细胞壁对于维持细胞结构、调控渗透压以及保护微生物具有重要作用。一旦这一过程被干扰，细菌将无法维持其结构完整性³。
PBP酶变异与抗药性的关系
每种细菌都有自己特定的 PBP 酶，每种菌株可能含有3至8种不同的PBP¹。对β-内酰胺类抗生素的耐药性正日益严重，其主要机制是由细菌产生的β-内酰胺酶介导。β-内酰胺酶可水解β-内酰胺环，使抗生素失活¹。因此，研究不同变异类型的PBPs，以了解其分子机制及其与β-内酰胺的结合行为至关重要。
肠球菌 (Enterococcus faecium )是一种可引发严重感染的细菌，且表现出高度的β-内酰胺耐药性。已有从临床分离出的、表现耐药性的PBP5变异体被鉴定⁴。有趣的是，这些突变并未改变PBP5的蛋白质结构²。本研究中，我们使用荧光偏振技术（fluorescence polarization, FP），测定青霉素与这些临床来源耐药性PBP5变异体的结合亲和力。
BOCILLIN FL 是一种荧光标记的青霉素衍生物（BODIPY标记的青霉素V）。如图1所示，当PBP5与BOCILLIN FL结合时，FP信号随时间增加，表明发生了结合事件。
图 1：BOCILLIN FL 荧光偏振动力学实验野生型及变异型PBP5蛋白按照Hunashal等人²先前的方法，从分离的肠球菌（Enterococcus faecium）变异株中表达并纯化。
BOCILLIN FL购自Thermo Fisher Scientific，并从1 mM的DMSO储备液中新鲜配制，实验中最终使用浓度为30 nM。实验用的缓冲液为：100 mM磷酸钠（pH 7.0）、0.01% Triton X-100，并加入黑色384孔板（聚苯乙//烯，Corning）中，每孔加5 µL。
实验通过向每孔加入15 µL PBP5蛋白（最终浓度3.6 µM）开始，并用热封膜（ThermalSeal，EXCEL Scientific）封板。阴性对照孔中不加PBP5，仅含缓冲液。
随后，在 37°C 温度下使用 CLARIOstarPlus测量荧光偏振，滤光片设置为荧光素。闪烁 100 次，目标 mP 值为 10mP。总共收集了 100 个测量点，每轮循环时间为 40 秒。
与 BOCILLIN 的相互作用
图 2 显示了野生型 PBP5（WT，即 PBP5 T485）随着时间的推移与 BOCILLIN 的结合情况，通过 FP 值的增加（绿色曲线）可观察到。正如预期，催化不活跃的 PBP5 S422A 变体没有与 BOCILLIN 结合（蓝色曲线），因为 β-内酰胺类药物严格要求与活性位点丝氨酸结合。
其中一个临床上最具耐药性的PBP5变体T485A，其与BOCILLIN的结合速率显著降低（红色曲线），接近S422A的无结合状态。相比之下，耐药性最弱的PBP5变体T485M，则表现出较高的结合速率（橙色曲线）。
图 2：WT、S422A、T485A 和 T485M PBP5 变体随时间变化的 BOCILLIN 荧光偏振曲线。结论
荧光偏振实验结果表明，β-内酰胺类抗生素通过PBP5活性位点中的S422残基特异性结合。不同的临床来源PBP5变体展示出显著不同的荧光偏振信号变化，与其临床耐药性水平密切相关。CLARIOstar Plus设备在监测这些变体结合行为差异方面表现出高度灵敏性，为结合动力学研究提供了强有力支持。该设备的温控功能确保了动力学实验中温度的稳定性和一致性。
References
- Bush, K., Bradford, P. β-Lactams and β-Lactamase Inhibitors: An Overview. Cold Spring Harb Perspect Med.(2016) Volume 6 (8) www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9957/#
- Hunashal, Y. et al. Molecular basis of β-lactam antibiotic resistance of ESKAPE bacterium E. faecium Penicillin Binding Protein. Nat. Commun. (2023) 14: 4268
- Yip, D., Gerriets, V., Penicillin. StatPearls Publishing. (2023)
- Rice L.B., Bellais S., Carias L. L., Hutton-Thomas R., Bonomo R. A., Caspers P., Page M. G. P., Gutmann L. Impact of specific pbp5 mutations on expression of
转载自：BMG LABTECH
欢迎关注进科驰安官方微信（微信公众号：Bio-Gene）
回复：BMG，查看更多相关视频
长按/扫描以下二维码可识别关注公众号
广州进科驰安科技有限公司
Bio-Gene Technology Ltd.
热线：176 2009 3784
www.bio-gene.com.cn
marketing@bio-gene.com.cn
香港 北京 上海 广州