生物芯片点样仪助甲型流感病毒感染的体液免疫差异化研究
2025-09-17 来源:本站 点击次数:57ArrayJet生物芯片点样仪助力SARS-CoV-2与甲型流感病毒感染的体液免疫差异化研究
SARS-CoV-2 与甲型流感病毒（IAV）均为严重威胁人类健康的呼吸道疾病。截至目前，COVID-19 全球感染人数已超过2.42亿，死亡近500万，且病毒持续变异出 Alpha、Beta、Delta、Omicron 等亚型，其中 Omicron 及其亚变体是当今全球的主流毒株。IAV自1918年以来共引发过四次大流行（如西班牙流感、香港流感等），现为季节性流行病。这两种疾病的临床症状相似（如发热、咳嗽），传播途径均以飞沫和接触传播为主，但 COVID-19 死亡率（3%-4%）显著高于 IAV（<1%），且急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、凝血功能障碍等并发症发生率更高，易与重症流感混淆，给临床诊断和治疗带来挑战。免疫系统在两种病毒感染过程中起关键作用。在体液免疫层面，SARS-CoV-2 感染常伴随细胞因子风暴和急性期反应物（APRs）异常升高，淋巴细胞数目、抗体表达水平均发生动态变化。然而，目前对两种病毒感染的自身抗体（AABs）谱、APRs 特征及血清学应答差异认识不足，限制了标志物发现、疫苗研发以及临床治疗。因此，亟需通过功能蛋白质组学解析二者在体液免疫应答方面的差异。
文章题目为“Humoral Response Profile in SARS-CoV-2 Infection: Differences across Virus Strains and Influenza”于2025年7月发表在Journal of Proteome Research杂志，作者来自于西班牙萨拉曼卡大学癌症研究中心。
作者对93个病例进行分析，分别是：SARS-CoV-2 野生型（武汉株）来自2020 年第一波疫情中轻、中、重度患者，入院当天采血，30例；SARS-CoV-2 变异株（Beta、Gamma、Delta、Omicron 等）第三至第六波疫情康复患者，确诊后3个月内采血，38例；IAV（H1N1、H3N2）2015-2016 及 2016-2017 年冬季康复患者，确诊后3个月内采血，25例；样本均来自荷兰国家公共卫生与环境研究所。所有样本均采集静脉血，分离血浆后于- 80℃保存。
作者对93个病例进行分析，分别是：SARS-CoV-2 野生型（武汉株）来自2020 年第一波疫情中轻、中、重度患者，入院当天采血，30例；SARS-CoV-2 变异株（Beta、Gamma、Delta、Omicron 等）第三至第六波疫情康复患者，确诊后3个月内采血，38例；IAV（H1N1、H3N2）2015-2016 及 2016-2017 年冬季康复患者，确诊后3个月内采血，25例；样本均来自荷兰国家公共卫生与环境研究所。所有样本均采集静脉血，分离血浆后于- 80℃保存。
急性期反应物（APRs）检测：使用ArrayJet Marathon（新型号Mecury）生物芯片点样仪将可识别24种急性期反应物（APRs）的抗体点印在功能化修饰的载玻片上，玻片包含 7 个相同的子阵列，每个子阵列有 432 个样品点，每种抗体 3 个重复。此外，所有子阵列中均包含阳性对照（Cy3、生物素和抗生物素抗体）和阴性对照（GST 抗体、PBS、清洗缓冲液、点样缓冲液和封闭缓冲液）。血清生物素化后与抗体微阵列进行孵育，并通过SensoSpot 荧光扫描仪对玻片进行扫描和数据分析（图1）。
自身抗体（AABs）谱分析：使用ArrayJet Marathon（新型号Mecury）生物芯片点样仪将编码 30 种不同蛋白的cDNA点印在玻片上，利用无细胞蛋白质合成系统，在阵列表面原位转录和翻译生成蛋白质。玻片包含 6 个子阵列，每个子阵列有 144 个点，每个点体积200 皮升。随后用 5% 牛奶封闭玻片10 分钟，并将血清样本以 1:100（v/v）的比例稀释，在室温下振荡孵育 30 分钟。然后用 0.05% PBST清洗3次，每次 5 分钟，随后加入 Alexa Fluor 647 标记的羊抗人 IgM 和 Cy3 标记的驴抗人 IgG（稀释比例 1:1000），孵育 20 分钟。最后使用 0.05% PBST清洗3次（每次 5 分钟），并用蒸馏水洗涤1次，离心干燥后，使用微阵列扫描仪进行扫描和数据分析（图1）。
图1：检测流程如上图
- 结果显示：
- 自身抗体（AABs）谱差异显著，相比于 IAV 患者，SARS-CoV-2 患者血浆中降钙素相关多肽α（CALCA，调节血钙）、肝细胞生长因子（HGF，促进血管生成）和免疫炎症相关分子（IL-6、IL-8、ICAM1、MUC1、TNFRS1A）表达升高。相比于SARS-CoV-2 患者，IAV 患者选择素 E（SELE，参与细胞外渗）、表面活性蛋白 D（SPD）和HMGB1（核染色质相关蛋白）呈现高表达水平。
- 急性期反应物（APRs）表达差异：SARS-CoV-2 患者 ，淀粉样蛋白（SAA2、APCS）、丝氨酸蛋白酶抑制剂（A1AT、CTRC）、凝血相关因子（FGA、F2、F8）、炎症标志物（CRP、ORM1）和铁代谢相关分子（THRB、FTH1）表达较高。IAV 患者仅视黄醇结合蛋白 4（RET4，参与维生素 A 转运）高水平表达（图2）。
图 2. 对 COVID-19 和流感患者急性期反应物进行评估。A. 比较两种病毒感染的各急性期反应物的箱线图（p 值：* < 0.05；** < 0.01）。红色代表 COVID-19 样本，绿色代表流感样本。y 轴表示 z 分数。B. 急性期反应物显著变化的火山图（p 值 < 0.05）。蓝色代表在 COVID-19 患者中升高的急性期反应物，红色代表在流感病毒感染中升高的急性期反应物，绿色代表无显著变化。x 轴表示 Z 比率，y 轴表示 -log10(p 值)。
- SARS-CoV-2 不同毒株的血清学应答差异：野生型毒株（武汉株）可诱导针对所有病毒蛋白（N、S、Orf1ab 等）的 IgM 和 IgG 应答，其中 N 蛋白的 IgG 表位识别频率最高（近 20%）。变异株（Beta、Omicron 等）感染初期可诱导 IgM 和 IgG 应答，后期仅维持 IgG 应答，且对S蛋白受体结合域（RBD）和 S 亚基的识别频率最高（图3）。
图 3. A. 武汉SARS毒株中 SARS-CoV-2 表位的阳性频率。B. SARS突变型中 SARS-CoV-2 表位的阳性频率。每个点代表一种被抗体特异性识别的表位。蓝色表示由 IgM 抗体检测到的表位，红色表示由 IgG 抗体识别的表位。曲线表示每种蛋白质中阳性表位的分布情况。x 轴表示根据每种蛋白质在每组中检测到的命中次数划分的 SARS-CoV-2 蛋白质区间。y 轴显示每种肽相对于所确定蛋白质的相对频率（%）。
- 结论：
该研究明确了 SARS-CoV-2 与 IAV 感染后体液免疫标志物的差异（如 CALCA、IL-8、RET4 等），为两种易混淆疾病的鉴别和诊断提供了理论依据，有助于提高临床诊断准确性；A1AT（抑制 SARS-CoV-2 刺突蛋白与细胞膜融合）在 SARS-CoV-2 感染中表达升高，提示其可能作为潜在的治疗靶点；凝血因子（FGA、F2）表达异常提示抗凝治疗可能对重症 COVID-19 患者有益；TNFRS1A 异常表达为抗 TNF-α 疗法在 COVID-19 中的应用提供理论基础。不同毒株的血清学应答特征，尤其是变异株对 RBD 的 IgG 应答优势，为多价疫苗设计（针对 RBD 和 S 亚基）提供参考。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.4c00935
Arrayjet位于英国爱丁堡，专注于提供生物芯片应用领域的解决方案及服务。自2000年公司成立即致力于开发新型生物样品喷点方案–喷墨式液体处理平台，该系统于2006年上市，目前用户遍布全球27个国家。
Mercury系列产品采用独特的飞行喷墨点样技术实现行业第一的快速、非接触式微量液体处理。同时上万种不同样品可以进行快速点样，专利的上样模块配合高通量的点样喷头保障您的点样操作快速、无污染，更低的上样体积可有效减少样品损失，使您的珍贵样品物尽其用。该系列产品制备高密度的蛋白微阵列芯片、抗体微阵列芯片、糖微阵列芯片、小分子化合物微阵列芯片等，用于自身免疫抗体、生物标记物、候选疫苗或靶点的高通量筛选，疾病研究和新药研发等诸多科研和临床领域。
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