本文要点：结直肠癌（CRC）是全球发病率最高的五大癌症之一。针对局部晚期CRC，临床推荐采用术前同步放化疗方案。作为传统癌症治疗手段，放疗（RT）不仅能控制局部肿瘤生长，还能诱导免疫原性细胞死亡并引发系统性免疫应答。鉴于CRC对放疗敏感性较差，提升放射增敏效果成为亟待解决的关键问题。虽然术中影像技术取得进展，但实现结直肠肿瘤实时精准切除并确保切缘阴性仍是重大临床挑战。本研究开发的新型多功能荧光纳米探针RVLu@ICG具有近红外二区（NIR-II）发光特性：通过环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸五肽（c(RGDfK)）修饰实现肿瘤靶向富集，并在电离辐射下显著增强活性氧（ROS）生成。这种协同机制既能增强放射增敏效果，又可促进放疗诱导的肿瘤免疫微环境重塑。NIR-II荧光成像导航系统成功在微小肿瘤模型、肌层浸润模型和腹膜转移模型中实现精准手术引导。该纳米探针在体外和体内实验中均表现出优异的生物相容性，为CRC治疗建立了可靠的精准诊疗一体化平台。

图1. 合成和应用的示意图：RVLu@ICG用于NIR-II荧光引导靶向放射增敏、免疫微环境调节和精确CRC手术切除的纳米探针

图2. 纳米探针的合成与表征

采用传统双相合成法和硬模板法制备了病毒模拟介孔二氧化硅纳米颗粒（VSi）。在弱碱性环境中温和搅拌72小时后，透射电子显微镜（TEM）观察到成功制备出粒径约100纳米、具有典型病毒样表面结构的均匀颗粒（图2A）。以VSi为核模板，六水合硝酸镥（Lu(NO3)3·6H2O）为镥源，乌洛托品为还原剂，经80/90℃反应17小时后，成功获得直径约110纳米的均一中空病毒样介孔氧化镥纳米球（VLu），其表面呈现粗糙形貌（图2A）。扫描电子显微镜（SEM）进一步证实VSi与VLu均具有均匀的仿生病毒样纳米结构（图2B）。高角度环形暗场扫描电镜（HAADF）结合元素分布图显示，Lu和氧（O）在单个VLu纳米结构中呈均匀空间分布，验证了镥整合中空纳米探针的成功构建（图2C）。通过氨基硅烷（APTES）对VLu进行氨基功能化后，使用NHS/EDC将c(RGDfK)肽段共价偶联至VLu表面（RVLu）。高分辨透射电镜（HRTEM）分析表明RVLu由相互贯穿的纳米颗粒组成（图2D），无晶格条纹的特征证实其非晶态性质。紫外-可见吸收光谱在258nm处出现c(RGDfK)肽段特征吸收峰（图2E），结合标准校准曲线定量显示c(RGDfK)负载率为17.01%（质量比1:11.76）。Zeta电位测试显示各制备阶段表面电荷变化（图2F），动态光散射（DLS）检测显示VLu、VLu-NH2和RVLu的流体力学直径分别为112.45nm、120.54nm和136.87nm（图S6），共同佐证了肽段偶联策略的有效性。

随后将ICG封装于中空RVLu颗粒中（RVLu@ICG），根据ICG标准曲线计算其负载效率达23.56%（图2G）。吸收光谱显示RVLu@ICG与游离ICG均在780nm附近存在特征峰，证实ICG成功嵌入纳米探针空腔（图2H）。在808nm激光激发并通过1000nm长通滤光片检测时，两者均表现出超过1000nm的NIR-II特征发射谱（图2I），验证了其在NIR-II窗口的光学活性。通过紫外分光光度计和电感耦合等离子体测定，RVLu@ICG中ICG、Lu与c(RGDfK)的摩尔比为1:330.65:18.54。

图3. 体外RVLu@ICG细胞毒性、细胞摄取和RT敏感性测试

癌细胞精准识别是实现肿瘤组织精准治疗的关键。采用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估RVLu@ICG的肿瘤靶向性能。在检测细胞摄取前，通过溶血实验和细胞增殖实验验证纳米探针的生物相容性。溶血实验结果显示（图3A），RVLu@ICG在所有浓度（0-80μM）下的溶血率均低于5%，表明其具有良好的血液相容性。实验评估发现，经c(RGDfK)修饰的RVLu@ICG在流式检测中细胞摄取量约为未修饰VLu@ICG的两倍（图3B），差异具有统计学意义（P<0.001）。CLSM观察显示，与CT26细胞共孵育4小时后，RVLu@ICG组的红色荧光（ICG）强度是VLu@ICG组的三倍（图3C；P<0.01）。通过竞争抑制实验发现，预先用过量c(RGDfK)肽处理的细胞对RVLu@ICG摄取显著降低（流式结果图S17-18，P<0.001；CLSM结果图3C，P<0.0001），证实c(RGDfK)功能化能赋予镥基纳米探针精准识别肿瘤细胞的能力。

随后研究者进一步评估了RVLu@ICG在放射治疗（RT）中的增敏效应。X射线照射（4 Gy）条件下，纳米颗粒（Lu³⁺浓度=20 μM）的细胞毒性显著高于单纯放疗组（P < 0.001），表明纳米颗粒介导的RT能显著增强辐射诱导的肿瘤细胞死亡（图3D）。通过克隆形成实验发现，相较于单纯RT组，RVLu@ICG联合处理组形成的存活细胞克隆数显著减少（P < 0.001）（图3E）。流式细胞术检测显示RVLu@ICG+RT组的细胞凋亡率显著高于单纯RT组（P < 0.001）（图3F）。值得注意的是，镥基纳米颗粒（RVLu@ICG）的放射增敏效果明显优于钆基（RVGd@ICG）和钕基（RVNd@ICG）材料（P < 0.001）。基于电离辐射通过活性氧（ROS）介导DNA损伤的机制，DCFH-DA染色显示：照射后RVLu@ICG组的绿色荧光强度与MFI值均显著高于PBS对照组（P < 0.0001）（图3H,I），而未照射组的荧光信号均较弱。流式检测证实RVLu@ICG+RT处理的CT26细胞ROS水平是单纯RT组的8倍（图3G），表明该纳米探针能通过显著提升X射线诱导的ROS产量，进而导致结直肠癌细胞凋亡/坏死。这些结果共同验证了RVLu@ICG具有强大的放射增敏作用，能有效抑制癌细胞增殖并诱导其死亡，是一种极具前景的放射治疗纳米剂。

图4. RVLu@ICG在体内安全性和肿瘤靶向效率评估

在开展活体荧光成像研究前，本文首先评估了RVLu@ICG的体内安全性。将健康雌性BALB/c小鼠随机分为四组实验，结果显示RVLu@ICG组与PBS对照组相似，在四周观察期内均未出现体重异常波动（图4A）。通过系列采集静脉血样（第0/1/7/28天）进行肝肾功能检测及血常规分析，发现肌酐（CREA）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）和尿素氮（BUN）水平保持稳定（图4B），血小板（PLT）、红细胞（RBC）、淋巴细胞（Lymph）及白细胞（WBC）计数亦无显著变化（图4C）。苏木精-伊红（HE）染色器官切片显示两组均未出现明显病理损伤（图4D），证实RVLu@ICG具有良好生物安全性。基于体外肿瘤靶向性和体内低毒性的验证结果，研究者在BALB/c小鼠皮下接种CT26-Luc肿瘤细胞建立模型。通过尾静脉注射ICG、VLu@ICG或RVLu@ICG后，采用808 nm激发光（100 mW/cm²）和1000 nm长通滤光片进行NIR-II荧光成像。结果显示ICG组肿瘤区域荧光信号微弱，而RVLu@ICG组在注射48小时后呈现强烈的肿瘤特异性荧光（图4E,F），其最大肿瘤背景比（TBR=6.50±1.10）显著高于VLu@ICG组（4.49±0.63）和ICG组（2.49±1.08）（图4G，P<0.05）。荧光信号在96小时后消退，但RVLu@ICG组在所有时间点均保持更高肿瘤荧光强度（图4F）。根据Rose标准（TBR>5可满足精准成像），RVLu@ICG展现出更优的肿瘤鉴别能力。通过预注射c(RGDfK)的阻断实验进一步验证靶向特异性，48小时后RVLu@ICG组的荧光强度（7.65±1.61）显著高于阻断对照组（2.40±0.44）（图4H；图S26，P<0.01）。离体器官荧光成像显示，注射48小时后纳米探针在肿瘤及网状内皮系统器官（肝、肾、肺）中均有较高蓄积（图4I,J）。这些结果共同证实RVLu@ICG具有精准的结直肠癌靶向能力。

基于Lu³⁺的X射线激活康普顿散射特性，通过静脉给药评估了RVLu@ICG对荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用。将携带CT26肿瘤的小鼠随机分为四组：PBS对照组、RVLu@ICG组、单纯放疗（RT）组及RVLu@ICG+RT联合组。如图5A、D、E所示，未照射的PBS组和RVLu@ICG组肿瘤持续生长；而X射线照射后，RVLu@ICG+RT组表现出显著增敏效果，肿瘤体积较单纯RT组明显缩小（图5A、F、G）。第18天解剖显示，联合治疗组肿瘤重量最轻（图5B、C），证实其具有最强的肿瘤清除与生长抑制能力。照射后6天小鼠体重短暂下降，第10天恢复至正常水平（图5H）。为深入评估疗效，治疗18天后对肿瘤组织进行病理学分析。Ki67增殖标志物染色显示，联合组的阳性细胞数显著低于其他组（图5I、J）；同时该组caspase-3活性明显升高（图5I、K），表明RVLu@ICG通过激活caspase-3及其下游通路协同促进肿瘤细胞凋亡。以上结果和HE染色结果共同验证了RVLu@ICG能有效增强放疗诱导的肿瘤细胞死亡并抑制进展。

图6. 微肿瘤模型、肌内肿瘤浸润模型和腹部转移癌模型中RVLu@ICG的手术导航

注射后48小时观察到最高肿瘤背景比（TBR），确定为近红外二区（NIR-II）荧光引导肿瘤切除的最佳时机。为评估纳米探针对微小肿瘤的术中检测能力，本文建立了多发性微小肿瘤模型。术中荧光信号与生物发光成像结果高度吻合（图8A），证实NIR-II荧光成像能精确界定肿瘤边界。对应HE染色显示，在NIR-II引导下切除的7个微肿瘤直径约0.5-3毫米，肿瘤与正常组织分界清晰（图8B）。值得注意的是，直径不足1毫米的T3、T4和T5微肿瘤均被准确识别，凸显RVLu@ICG对术中残留微小病灶的检测优势。

通过构建肌肉内肿瘤浸润模型，研究者验证了RVLu@ICG探针在荧光成像系统中精确定位肿瘤的可行性。将CT26-Luc细胞植入BALB/c小鼠肌肉组织形成300-400 mm³肿瘤后，在无菌条件下麻醉荷瘤小鼠。如图8C所示，注射RVLu@ICG 48小时后，肿瘤边缘通过NIR-II成像系统清晰显现（图8C I,IV）。白光下切除原发灶（P1）后，NIR-II成像发现术床残留荧光信号（图8C II,V），遂追加切除（P2）。808 nm激光复检确认荧光信号完全消失（图8C III,VI）。离体成像显示P1/P2具有强荧光而肌肉组织无信号（图8E），HE染色证实荧光区域均为肿瘤组织（图8F），表明该探针可有效区分肿瘤与正常组织。相比之下，ICG组多数残留肿瘤无荧光信号（图8D），凸显传统染料的局限性。

术后14天生物发光成像显示，RVLu@ICG引导手术组无局部复发或远处转移，而ICG组80%小鼠及对照组全部出现原位复发。生存分析显示RVLu@ICG组小鼠生存期显著优于ICG组与白光手术组（图8G）。进一步在结直肠癌腹膜转移模型中评估了RVLu@ICG近红外二区纳米探针的术中成像潜力。生物发光成像首先确认了肿瘤存在并提供了大致定位。在无菌条件下对异氟烷麻醉的小鼠实施手术，通过NIR-II荧光成像依次引导肿瘤切除（图8H）。NIR-II成像清晰显示了1-8号肿瘤边界（图8H），切除组织的HE染色验证了肿瘤边缘的精准界定（图8I）。术后14天的生物发光监测显示，所有手术区域均未出现局部复发或转移迹象。

本文成功开发出具有优异生物相容性和高光稳定性的创新型近红外二区（NIR-II）可降解荧光纳米探针RVLu@ICG，该探针集放疗增敏、免疫微环境重塑和手术精准导航三大功能于一体。基于高原子序数元素镥（Lu）显著的X射线吸收效率，RVLu@ICG不仅能增强结直肠癌肿瘤的放射敏感性，还能通过放射增敏效应重塑肿瘤免疫微环境，从而激活免疫系统放大免疫杀伤效应。在多种荷瘤模型实验中，该探针可精准引导NIR-II荧光成像实现肿瘤根治性切除，显著提高实验对象总体生存率。更值得关注的是，该纳米探针无毒性且不会造成器官损伤或急性危害，展现出良好的临床转化前景。这种多功能探针为结直肠癌制定了完整的精准治疗方案：术前通过新辅助放疗联合免疫微环境重塑实现肿瘤细胞最大程度清除和瘤体减容；术中借助NIR-II荧光导航精准切除残余微病灶。这种整合治疗策略对改善患者生存预后具有重大意义，有望成为临床肿瘤治疗的优选方案。

参考文献

Dang Y, Liu X, Zheng Z, et al. Lutetium‐Based Nanoprobes for Radiosensitization with Immune Microenvironment Remodeling and NIR‐II Fluorescence Imaging‐Guided Surgery in Colorectal Cancer[J]. Advanced Science, 2025: e10136.

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