利用NIR-II 成像进行精确接种增强 mRNA 疫苗的功效
2025-09-19 来源:恒光智影 点击次数:76本文要点：本文将阳离子荧光两亲性分子（IR780-C16）整合到传统脂质纳米颗粒（LNPs）中，制备了近红外二区（NIR-II）脂质纳米颗粒（NIR-II-LNPs），用于mRNA递送，实现了mRNA疫苗的纵向、定量和非侵入性追踪。通过NIR-II荧光成像，监测了小鼠和兔子在不同疫苗接种方案下mRNA疫苗的体内行为。结果表明，在小鼠大腿肌内注射25 µL（深度4 mm）或兔子肌内注射500 µL（深度7 mm）后，疫苗迅速且大量富集于腹股沟淋巴结。流式细胞术和组织免疫荧光分析进一步验证，优化的疫苗接种参数可有效激活抗肿瘤免疫，并在B16-OVA和HPV相关小鼠肿瘤模型中显著增强治疗效果。NIR-II-LNPs提供了一种独特的非侵入性监测疫苗效果的方法，巩固了其在临床前和临床mRNA治疗中的作用。
本文通过将IR780-C16整合到脂质纳米颗粒（LNPs）中，开发了新型近红外二区荧光LNPs（NIR-II-LNPs），用于实时监测疫苗分布并验证疫苗接种方案与免疫应答的关联性（方案1）。在小鼠和兔子模型中采用不同注射深度和体积接种后，NIR-II-LNPs实现了对mRNA疫苗迁移和摄取的非侵入性、动态定量追踪。研究发现，当采用最佳深度进行肌内注射时，mRNA疫苗能快速迁移至腹股沟淋巴结（iLNs），而不当的注射方案则会导致信号长期滞留于注射部位。进一步构建了mRNA癌症疫苗（NIR-II-LNPs@mRNAOVA、NIR-II-LNPs@mRNAE7），在B16-OVA和HPV相关荷瘤小鼠模型中分析其动态分布对免疫应答及抗肿瘤效果的影响。实验证实，采用优化接种参数的NIR-II-LNPs@mRNA疫苗能显著促进树突细胞（DCs）成熟、提升抗原特异性T淋巴细胞水平，并显著增强抗肿瘤效果。该研究充分展现了NIR-II-LNPs作为新一代载体在优化mRNA疫苗接种方案和提升疫苗效能方面的卓越潜力。
图1. NIR II LNPs示意图和表征
IR780-C16用于标记传统脂质纳米颗粒（LNPs），形成的近红外二区（NIR-II）荧光探针具有毫米级组织穿透深度和优异信噪比。LNPs由ALC-0315（50%）、DSPC（10%）、ALC-0159（1.5%）和胆固醇（38.5%）按特定摩尔比组成（图1A-C），而NIR-II-LNPs在此基础上整合了0.5%质量比的IR780-C16（图1A,B），其封装效率超过96%。动态光散射（DLS）显示LNPs和NIR-II-LNPs的流体力学直径分别为78.4±1.7 nm和75.0±1.6 nm（图1D,G），冷冻透射电镜（Cryo-TEM）证实二者均呈均匀球形（图1E,H）。Zeta电位分析表明IR780-C16的引入未影响纳米颗粒组装（图1I），且在PBS中一周内粒径保持稳定（图1J）。紫外-可见光谱显示NIR-II-LNPs在790 nm处有特征吸收峰（图1C,F,K），并在NIR-II光谱区（>1000 nm）呈现显著荧光增强（图1L），其量子产率较游离IR780-C16提升11.3倍（图1M），这归因于纳米载体抑制了分子间π-π堆积和内部旋转，减少了聚集诱导淬灭效应。在808 nm激光持续照射下，NIR-II-LNPs在1400 nm亚NIR-II窗口仍保持稳定荧光强度（图1N,O）。组织模拟实验显示，相较于NIR-I窗口（850-900 nm）的局限穿透（<3 mm）和严重散射，NIR-II成像（>1100 nm）在7 mm深度仍能清晰分辨毛细血管边缘（图1P），且半峰宽（FWHM）更窄（图1Q），充分证明NIR-II-LNPs适用于深层组织成像。
图2. 不同注射方案的NIR-II成像研究
肌内注射作为一种广泛采用的疫苗接种方式，其注射深度对免疫应答的激活具有决定性作用。本文采用NIR-II-LNPs作为递送载体，实现了mRNA疫苗在体内迁移和生物分布的可视化追踪。通过在C57BL/6小鼠右大腿分别以2 mm（I组）、4 mm（II组）、6 mm（III组）深度注射25 μL NIR-II-LNPs@mRNA（图2A），动态监测显示：I组疫苗在注射4小时后腹股沟淋巴结（iLNs）信号达到峰值，而II组和III组在24小时内持续富集，其中II组荧光强度显著优于其他组（图2B,C）。24小时后组织分布分析证实，II组iLNs中疫苗蓄积量分别是I组和III组的4.4倍和2.0倍（图2D-F）。进一步探究注射体积影响时发现，在最佳深度下，50 μL注射量能最有效促进疫苗向iLNs转运，而100 μL组则导致更多疫苗在肝脏蓄积。实时荧光成像清晰捕捉到疫苗在最佳接种条件下经淋巴管向iLNs和腋窝淋巴结（aLNs）迁移的动态过程（图2G）。该研究首次通过NIR-II成像技术建立了疫苗接种参数与免疫效能的定量关系，为优化mRNA疫苗递送方案提供了可视化依据。
图3. 兔子NIR-II成像研究
为排除可能阻碍临床转化的物种特异性差异，研究人员在雌兔模型中评估了NIR-II-LNPs@mRNA的生物分布特性。实验采用三种不同注射深度（图3A,B）肌注500 µL疫苗，结果显示：7 mm注射组在给药4小时内即可在腹股沟淋巴结（iLNs）快速蓄积，而4 mm和10 mm组iLNs区域几乎检测不到信号（图3C-E）。这一结果明确证实，疫苗的有效递送依赖于最佳深度的精准注射，从而验证了前述结论的准确性和普适性。通过NIR-II体视显微技术进一步观察发现（图3F,G），疫苗荧光信号主要富集于iLNs边缘的被膜下窦（SCS）区域（图3H），表明抗原通过输入淋巴管运输后被沿SCS分布的抗原呈递细胞（APCs）捕获。该研究实现了疫苗在淋巴结迁移滞留过程的实时示踪，为优化疫苗剂量和注射方案提供了强有力的研究工具。
图4. 荷瘤小鼠疫苗接种的治疗实验
淋巴结是抗原呈递细胞（APCs）与初始T细胞相互作用、引发T细胞依赖性免疫应答的关键场所。理想的疫苗接种方案应能促进APCs成熟、增强APCs-T细胞互作并激发强效免疫反应，从而实现低抗原用量下的长效免疫（图4A）。研究者在B16-OVA荷瘤小鼠模型中评估了不同接种方案对肿瘤引流淋巴结（dLNs）中APCs及外周血T细胞的影响（图4B）。将5 μg编码OVA（257-264）-荧光素酶的mRNA（mRNAOVA-Luc）封装于NIR-II-LNPs（终体积25 μL），分别以2 mm、4 mm、6 mm深度肌注小鼠右腿后，4 mm深度组dLNs显示出最强的生物发光信号（图4C），证实该深度能显著提升mRNA体内翻译效率。流式细胞术检测发现，4 mm-50 μL组（V组）DCs表面H-2Kb/SIINFEKL复合物阳性率（29.9%）较对照组（4.96%）提升6倍（图4D,E），免疫荧光分析同样显示该组DCs活化标志物CD80/CD86表达最显著（图4G）。二次免疫7天后，4 mm-50 μL组外周血肿瘤特异性CD8+ T细胞比例达20.5%（对照组5.44%），同时OVA特异性IgG抗体滴度显著升高（图4H,I）。这些数据表明，优化后的接种参数（4 mm深度+50 μL体积）能协同增强mRNA疫苗的抗原呈递、T细胞激活及体液免疫应答，且未引起明显体重变化。
图5. NIR-II-LNPs@mRNAE7癌症疫苗治疗研究
本文在TC-1皮下肿瘤模型中评估了NIR-II-LNPs@mRNAE7疫苗的抗肿瘤效果。该疫苗靶向E7癌蛋白，能有效对抗以HPV16型为主的高危HPV毒株——宫颈癌的主要致病因子。实验方案如图5A,B所示：第0天接种TC-1细胞，第10天进行初免，第17天加强免疫。通过监测肿瘤生长曲线发现（图5C,D），采用优化接种参数（4 mm-50 µL）的疫苗组展现出持续抑瘤效果，肿瘤生长抑制率（TGI）高达70.9%（图5E-G），并显著延长了小鼠中位生存期（图5H）。机制研究表明，疫苗组引流淋巴结中CD80+CD86+细胞比例显著高于对照组（50.3% vs 11.0%），尤其是4 mm-50 µL组DCs活化水平最为突出（图5I,J）。肿瘤组织免疫荧光分析显示，疫苗组肿瘤浸润CD8+和CD4+ T细胞数量明显增加，并伴随穿孔素（PFN）和颗粒酶B（GzmB）等杀伤分子的大量分泌（图5K）。血液生化及主要器官H&E染色证实疫苗未引起明显毒性反应，表明该mRNA疫苗在实现卓越抗肿瘤效果的同时具有良好的安全性。这些发现证实，疫苗的精准递送对激发最佳T细胞免疫至关重要。
综上所述，本文成功开发了新型近红外二区（NIR-II）发光脂质纳米粒（NIR-II-LNPs），实现了mRNA的高效递送与疫苗运输过程的非侵入式成像。NIR-II示踪数据直接证明：疫苗注射深度和体积显著影响其体内分布，并最终调控疫苗特异性免疫反应的强度。实验表明，当纳米疫苗精准注射至最佳组织深度时，能更有效地通过淋巴管迁移至腹股沟淋巴结（iLNs）。得益于在淋巴结的高效蓄积及优化接种参数下树突细胞（DCs）的强力激活，两种肿瘤疫苗（NIR-II-LNPs@mRNAOVA和NIR-II-LNPs@mRNAE7）在B16-OVA和HPV相关小鼠肿瘤模型中均展现出卓越的抗肿瘤效果。相较于传统需处死动物的离体研究，本研究首创了非侵入、纵向、实时的体内mRNA疫苗示踪策略，为探索不同接种条件下的疫苗效力提供了关键依据。该平台技术有望拓展至其他疫苗的体内研究，加速免疫效果验证并指导更有效疫苗的设计。
参考文献
Mengfei Li, Xue Zheng, Xinyang Yu, Shaolong Qi, Shoujun Zhu,* Guocan Yu, and Songling Zhang., Potentiating the Efficacy of mRNA Vaccines through NIR-II Imaging-Guided Precise Vaccination., Adv. Sci. 2025, e13014
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