文献信息
暨南大学生命科学与技术学院生命与健康工程研究所广东省高校功能蛋白研究重点实验室和教育部肿瘤分子生物学重点实验室等单位的研究成果“REPS2 attenuates cancer stemness through inhibiting Wnt signaling by autophagy mediated degradation of β-catenin（REPS2通过自噬介导的β-catenin蛋白的降解来抑制Wnt信号通路从而抑制肿瘤细胞的干性）在杂志《Oncogene》（IF：7.3）上发表。平生公司的活体CT（Super nova）在论文中提供了重要的小鼠肺部肿瘤图像。

该研究的通讯作者陈良教授，第一作者为刘鹭老师。

文献背景
调节肺癌细胞干性的肿瘤抑癌基因（TSG）仍有待确定。作者利用CRISPR/Cas9介导的全基因组规模的关于肺癌干性基因的筛选，并确定REPS2是一种有效的TSG，对肺癌细胞的干性进行负调控。其抑癌作用在体外和体内都得到了证实。从机制上讲，P62同时与β-catenin和REPS2相互作用，导致自噬溶酶体介导的β-catenin的降解从而抑制Wnt信号传导。β-catenin的抑制剂与驱动突变抑制剂协同诱导免疫原性细胞死亡，可用于提高肿瘤免疫治疗的疗效。

实验方法
动物实验
对于异种移植瘤模型，在6-8周龄的雌性裸鼠皮下植入2×10⁶个A549细胞系，这些细胞系具有通过CRISPR筛选敲除的前10个候选基因。将小鼠随机分为几组，每组三只。4周后，处死小鼠并解剖肿瘤负荷。对于LLC异种移植瘤模型，在6-8周龄的雌性WT小鼠上皮下接种2×10⁶ LLC（Vehicle或OE REPS2）。将小鼠随机分组，每组4只。肿瘤体积达到100mm³时进行测量。2周后，处死小鼠并解剖肿瘤负荷。

将过表达REPS2（KC+R）或Vehicle的逆转录病毒通过鼻孔吸入6-8周龄的TetO-KrasG12D/CC10rtTA（指定为KC）双转基因雌性小鼠的肺部。将小鼠随机分组，每组4只。所有小鼠均喂食含有Dox的食物3个月。计算机断层扫描（Super nova CT，平生医疗科技有限公司）用于量化肿瘤负荷。

将含有Cre和Cas9的慢病毒注入6-8周龄的LSLKRASG12D雌性小鼠的肺部。感染后6个月，通过CT监测REPS2基因敲除小鼠（K-sgREPS2小鼠）和TdTomato基因敲除鼠（K-sgTD小鼠作为对照）的肿瘤负荷。对于K-sgREPS2小鼠治疗，将小鼠随机分为几组，每组4只。用ICG001（腹膜内注射，25mg/kg/天）、曲美替尼（强饲，1mg/kg/天）和PD-1抗体（腹膜内注入，5mg/kg/天）治疗小鼠2周。通过计算机断层扫描监测肿瘤负荷。

实验结果
REPS2在体内肺癌小鼠模型中是一种有效的肿瘤抑制因子
将REPS2过表达LLC细胞的同种异体移植肿瘤（LLC-REPS2oe）的生长速度明显慢于对照细胞（图4A）。此外，作者发现REPS2的过表达显著抑制了CD44的表达（图S4A）。小鼠原位肺癌模型更好地再现了患者肿瘤发展的临床过程。前期，作者报道了一种肺癌小鼠模型TetO-KrasG12D；CC10rtTA（指定为KC小鼠），在四环素饮食诱导（Dox）3个月之后，由KrasG12D驱动发展为肺癌。然后，作者通过鼻内滴注（指定为KC+R）用含有Teton-REPS2的慢病毒感染这些小鼠。WB分析证实了Dox诱导3个月后KC+R小鼠肺组织中REPS2的表达（图S4B）。作者发现REPS2的过度表达显著抑制了肺癌的形成（图4B–F）。苏木精和伊红（H&E）染色检查显示，REPS2的过度表达显著抑制了KC+R小鼠肺癌的形成（图4B）。此外，作者发现REPS2的过表达显著抑制了对CD44的表达（图S4C）。相反，按照先前报道的通过CRISPR/Cas9系统在Lsl-KrasG12D转基因小鼠的肺癌小鼠模型中敲除肿瘤抑制基因的程序，作者将靶向Td-tomato（作为阴性对照，K-sgTD）或REPS2（K-sgREPS2）的慢病毒鼻内递送到Lsl-KrasG12D小鼠中。与对照组相比，经鼻吸入慢病毒6个月后，作者检测到REPS2敲除小鼠的肿瘤负荷、肿瘤数量、最大肿瘤直径和III期肿瘤数量显著增加（图4G-K）。此外，作者通过免疫组织化学检测到REPS2敲除的肿瘤中CD44的表达显著升高（图S4D，E）。

图4 REPS2在体内肺癌小鼠模型中是一种有效的肿瘤抑制因子。A. REPS2过表达对LLC异种移植物肿瘤的影响。肿瘤体积和肿瘤重量统计如下。B.REPS2过表达对转基因小鼠原位肺肿瘤形成的影响。相应的HE分析图像如下所示。C-F.肿瘤负荷、肿瘤数量、最大肿瘤大小和肿瘤III期数量的统计数据。G.敲除REPS2对Lsl-KrasG12D小鼠肿瘤形成的影响。相应的HE分析图像如下所示。H-K肿瘤负荷、肿瘤数量、最大肿瘤大小和肿瘤III期数量的统计数据。

联合抑制WNT/β-catenin通路和MEK增强REPS2缺陷/Kras突变型肺癌免疫治疗

作者生成了一批携带K-sgREPS2肺癌的小鼠，并用ICG001、曲美替尼和PD-1抗体治疗这些小鼠2周。作者发现，与ICG001和曲美替尼的组合相比，ICG001、曲美替尼和PD-1抗体治疗显著抑制了肿瘤生长（图7E、F）。此外，FACS分析显示，联合治疗显著增加了肿瘤浸润CD8+T细胞中TNF-α的表达（图7G，H）。综上所述，这些数据表明，ICG001、曲美替尼和PD-1抗体的组合有效地抑制了KrasG12D/REPS2-/-肺癌。

图7 联合抑制WNT/β-catenin通路和MEK增强REPS2缺陷/Kras突变肺癌免疫治疗。E .ICG001、曲美替尼和PD-1抗体联合治疗可有效缩小K-sgREPS2小鼠的肺肿瘤。相关HE分析如下所示。F.用（E）的联合疗法治疗的小鼠肿瘤负荷的定量。

文献结论

免疫疗法改变了当前临床肿瘤学实践的范式。不幸的是，大多数患者未能从免疫疗法中受益。典型免疫疗法的组合，如PD-1抑制剂和CTLA4抑制剂之间、PD-1和LAG3之间以及PD-1和TIGIT之间，正在临床试验中积极测试。免疫疗法也与化疗和靶向治疗相结合。然而，在上述所有组合中，耐药性仍然是一个棘手的问题。作者目前的工作为一个研究不足的领域提供了新的思路：通过识别强效TSG的功能丧失并阐明随之而来的异常信号，研究人员可以识别由这种异常信号产生的药物靶点。因此，考虑到这些药物与免疫疗法的潜在联合，可能会导致治疗效果的增强。

使用设备

     
Micro CT（型号：Super Nova）（平生医疗科技）
 影像软件：Avatar（平生医疗科技）