文献信息
湖北省肿瘤生物学行为重点实验室，湖北省肿瘤生物学行为重点实验室，武汉大学中南医院放射与医学肿瘤科，医学研究院，免疫与代谢前沿科学中心等团队的研究成果“USP2 inhibition unleashes CD47-restrained phagocytosis and enhances anti-tumor immunity”（抑制USP2解除CD47介导的吞噬抑制作用，并增强抗肿瘤免疫）在学术期刊《Nature Communications》（IF：14.7）上发表。平生公司的离活一体CT（NEMO）在论文中提供了小鼠肺部肿瘤图像和定量分析结果。

该论文的通讯作者为张金方教授，第一作者为代盼盼老师。

文献摘要
CD47/SIRPα轴传递“不要吃我”的信号，从而阻碍肿瘤细胞的吞噬清除。尽管靶向CD47的阻断抗体在临床前模型中显示出有希望的抗肿瘤效果，但涉及人类癌症患者的临床试验尚未产生理想的结果。探索CD47的调控机制对于设计更有效的组合疗法至关重要。在这里，作者报告说，抑制USP2会促进CD47降解并重塑肿瘤微环境（TME），从而增强抗PD-1免疫治疗。从机制上讲，USP2与CD47相互作用，通过去泛素化修饰使其蛋白稳定。抑制USP2会破坏CD47的稳定性，从而增强巨噬细胞的吞噬作用。单细胞RNA测序显示抑制USP2重编程TME，具体表现为抑制USP2增加M1巨噬细胞和CD8⁺T细胞的浸润，同时减少M2巨噬细胞的浸润。将ML364与抗PD-1抗体联合使用可减轻小鼠模型中的肿瘤负担。在临床水平上，USP2低表达预示着对抗PD-1治疗的更好反应。作者的发现揭示了USP2对CD47的调控机制，靶向这一信号轴可以增强抗肿瘤免疫。

实验方法
对于原发肺肿瘤模型，KrasLS^L-G12D/+；使用Trp53^fl/fl（KP）和Kras^LSL-G12D/+Trp53^fl/fl Usp2^−/−（KPU）小鼠。KPU小鼠是通过将KP小鼠与Usp2−/-小鼠交配而产生的。为了诱导肺部肿瘤发生，用1%戊巴比妥钠麻醉7周龄的KP和KPU小鼠，并在每只小鼠鼻内滴注50μl PBS（含有2×10⁶pfu腺病毒Cre）。诱导5周后，进行治疗。在图7a中，KP小鼠被合并并随机分为对照组、ML364组、抗PD-1单克隆抗体组和联合治疗组。KP小鼠每三天腹腔注射抗PD-1单克隆抗体（每只小鼠100μg），共7次治疗，或每天注射ML364（5mg/kg小鼠体重），共21次治疗。在图7e中，KP和KPU小鼠分别分为对照组和抗PD-1单克隆抗体治疗组。KP或KPU小鼠每三天通过腹腔注射抗PD-1单克隆抗体（每只小鼠100μg）给药，共7次治疗。治疗21天后，分离KP和KPU小鼠的全肺进行H&E染色和分析。

应用小型动物微型CT扫描仪（NEMO^®Micro-CT，平生医疗科技有限公司）扫描不同治疗组的小鼠，进行活体成像，以显示肺部病变。简而言之，使用2%-3%的异氟烷对动物进行麻醉，将其放置在恒温控制的CT床上，并通过鼻锥输送1%-1.5%的异氟烷，使其保持麻醉状态。小鼠处于仰卧位，使用Cruiser扫描软件（平生医疗科技有限公司）执行标准CT扫描协议。同时，使用呼吸门控垫片监测小鼠的实时呼吸频率，每只小鼠的总扫描时间约为10分钟。CT扫描完成后，根据制造商的说明，按照Avatar分析软件（平生医疗科技有限公司）程序对数据集进行重建和成像。根据仪器制造商的指南，在Avatar程序中进行了整个肺的3D重建和重建肺的体积计算。

实验结果
为了进一步研究USP2抑制在体内调节抗PD-1免疫治疗中的作用，作者使用了基因工程的Kras^LSL-G12D/+；Trp53^fl/fl（KP）小鼠肿瘤模型，在鼻内滴注表达Cre重组酶的腺病毒（Ad-Cre），诱导其形成原位肺肿瘤。携带肺肿瘤的KP小鼠接受ML364单药，抗PD-1单克隆抗体单药或联合腹腔注射治疗（图7a）。与同基因小鼠LLC肿瘤模型的结果一致（图4），与ML364或抗PD-1抗体单一疗法相比，联合治疗显著抑制了KP小鼠的肿瘤发展，具体表现为肿瘤面积的减小和肿瘤面积占全肺面积比例的减小（图7b-d）。

接下来，作者在KP小鼠中基因敲除了Usp2，并探讨了Usp2缺乏对肺癌进展和免疫疗法反应的影响。为此，通过KP小鼠交配Usp2^−/−小鼠产生KPU小鼠（补充图9a-d）。用抗PD-1抗体或对照IgG治疗携带Ad-Cre诱导肺肿瘤的KP和KPU小鼠（图7e）。然后，作者对小鼠进行了CT扫描活体成像，展示小鼠肺部病变，同时对不同治疗组的小鼠全肺进行了3D重建。随着肿瘤侵袭邻近正常肺组织，肺实质结构完整性逐渐丧失，其肺缺损体积随肿瘤进展呈进行性增大。因此，重建的健康肺间质的体积被用作自发肺癌进展的替代标志物。全肺体积定量显示，与其余处理组相比，KPU联合PD-1单克隆抗体治疗组的残余肺体积明显更大，肿瘤进展明显减缓（图7f，g）。值得注意的是，肺部的H&E染色显示，与其他治疗组小鼠相比，经过PD-1抗体治疗的KPU小鼠显著延缓了肺部肿瘤发展（图7h-j）。总之，这些结果表明，在KP肺癌模型中，通过其小分子抑制剂ML364或基因缺失抑制USP2使肺肿瘤对抗PD-1抗体免疫疗法更敏感。

图7|ML364或基因缺失抑制USP2克服了Kra^sLSL-G12D/+ Trp53^fl/fl（KP）小鼠对抗PD-1抗体免疫疗法的耐药性。a KP鼠原发性肺肿瘤的治疗方案示意图。KP小鼠经鼻注射Ad-Cre，剂量为2×10⁶pfu/只。诱导后五周，分别用ML364（5mg/kg）、抗PD-1单克隆抗体（每只小鼠100μg）或联合治疗对小鼠进行治疗。b-d不同处理组小鼠肺组织的代表性H&E染色图像（b），通过测量所有肺肿瘤的横截面积来量化肿瘤大小（c），并根据每只KP小鼠的三个非连续切片计算肿瘤面积占全肺面积的比例（%）（d）。e KP和KPU小鼠原发性肺肿瘤的治疗示意图。KP和KPU小鼠经鼻注射Ad-Cre，剂量为2×10⁶pfu/只。诱导五周后，按照指示用对照载体或抗PD-1单克隆抗体（每只小鼠100μg）治疗小鼠。f 不同治疗组KP和KPU小鼠的活体扫描肺部成像。Micro-CT扫描的三维图像显示肺部呈现灰色。g通过Avatar软件的3D重建，使用算法提取每组小鼠的健康肺体积进行量化。h–j不同处理组小鼠H&E染色肺组织的代表性图像（h），通过测量所有肿瘤的横截面积来量化肿瘤大小（i），并根据每只KP或KPU小鼠的三个非连续切片计算肿瘤面积占全肺面积的比例（%）（j）。

使用结论
先前的研究表明，USP2对多种癌症的肿瘤发生和转移有促进作用，这表明靶向USP2可能是人类癌症的一种潜在治疗策略。此外，Usp2 KO小鼠是不影响小鼠稳态的，并且用Usp2抑制剂ML364治疗小鼠没有显示出明显的毒性迹象，这进一步支持了USP2可能是癌症治疗的理想靶点的观点。值得注意的是，在多个临床前肺癌模型中，USP2抑制剂与抗PD-1抗体联合治疗显著抑制肺肿瘤生长（图4和图7）。此外，安全性评估表明，联合治疗不会引起明显的血液和器官系统毒性。这些结果与最近的文章报道结果是一致的，在同基因小鼠乳腺肿瘤模型中，USP2抑制使肿瘤对PD-1阻断抗体更敏感，而没有明显的毒性，这一抗肿瘤作用主要是通过USP2-VPRBP间接上调p53和PD-L1水平来实现的。p53通路的激活和USP2抑制介导的PD-L1表达的上调也有助于形成炎症性TME，这与作者的主要结论一致。结合作者发现的去泛素化酶USP2调节CD47蛋白稳定性和肿瘤免疫微环境，这些研究为USP2抑制剂与PD-1/PD-L1阻断抗体联合治疗改善肿瘤治疗效果提供了充分的分子基础。

使用设备

  Micro CT (型号：NEMO) (平生医疗科技)
影像软件：Avatar（平生医疗科技）