本文要点：本研究开发了一种肿瘤靶向纳米抗体平台，通过白蛋白结合和染料封装实现近红外二区（NIR-II）成像引导的光动力治疗。该平台通过基因工程改造纳米抗体使其与人血清白蛋白（HSA）特异性结合，形成单分散递送载体。白蛋白空腔封装IR808染料后，在808 nm激光激发下可同步增强NIR-II荧光与单线态氧生成。这种亲和力驱动的自组装技术构建了均质性纳米抗体-白蛋白复合平台，其中白蛋白结合使纳米抗体药代动力学显著改善，肿瘤蓄积量远超清除器官滞留量。在结直肠癌移植瘤模型中，仅需420 J/cm²的低剂量近红外光照射即可实现高对比度NIR-II成像与高效光动力治疗。该研究凸显了自组装纳米抗体平台的生物衍生特性与卓越疗效，为设计精准诊疗剂提供了新策略。

本文研发了一种肿瘤靶向纳米抗体平台，该平台通过白蛋白与染料结合进行封装，利用近红外二区（NIR-II）成像引导光动力治疗。构建肿瘤靶向纳米抗体-白蛋白平台的策略如方案1所示。前期研究表明，通过基因工程引入白蛋白结合结构域（ABD）的纳米抗体可借助内源性白蛋白结合延长血液循环时间。本研究利用纳米抗体-白蛋白结合与白蛋白-染料封装技术，组装出用于NIR-II成像引导光动力治疗的诊疗一体化平台。研究者筛选了两种近红外花菁染料（含氯IR808与无氯ICG）进行HSA封装，并系统考察HSA-染料探针的光物理性质。值得注意的是，在近红外光激发下，该染料的荧光亮度、光稳定性及单线态氧生成效率均获得显著提升。荷瘤小鼠模型体内实验显示，相较于单纯白蛋白递送系统，该纳米抗体平台具有显著的肿瘤靶向蓄积特性，光动力治疗效果大幅增强。本研究为开发兼具高特异性与高载药能力的生物基诊疗一体化平台提供了创新方案。

方案1. NIR-II成像和光动力治疗的具有增强荧光亮度和单线态氧产生的肿瘤靶向纳米体HSA治疗平台的构建示意图

染料与HSA按不同分子比在50℃孵育2小时完成封装（图1a），采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析不同摩尔比的HSA-染料复合物。由于SDS-PAGE会使蛋白质变性并破坏白蛋白疏水腔结构，该方法可有效表征染料封装机制。如图1b所示，HSA-IR808电泳条带呈现强烈荧光信号，证实IR808与HSA形成稳定复合物；而HSA-ICG条带荧光信号可忽略，表明其在SDS-PAGE处理过程中发生解离。该现象与既往研究一致：含氯菁染料可通过与疏水腔内半胱氨酸残基共价结合，形成稳定荧光复合物。值得注意的是，当IR808与HSA摩尔反应比为2:1时，HSA-IR808复合物荧光强度达到峰值，提示白蛋白空腔达到染料封装饱和。最终选择2:1摩尔比的HSA-IR808复合物进行后续研究。

采用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对HSA-IR808复合物的光物理性质进行表征。紫外-可见光谱显示，与游离IR808相比，HSA-IR808复合物的吸收峰出现20 nm的红移，且溶液颜色因近红外吸收增强而发生显著变化（图1c）。荧光光谱中同样观察到发射红移，且荧光强度大幅提升（图1d）。这一现象归因于染料分子与白蛋白Trp214残基之间形成大π-π共轭体系，降低了最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道（HOMO-LUMO）能隙，从而诱导吸收波长红移。此外，研究表明白蛋白对水溶液中的菁染料具有双重保护作用，既能防止聚集，又可限制光照下的光氧化裂解反应。基于此效应，本文考察了HSA-IR808在连续激光照射下的光稳定性。实验发现，10分钟激光照射后，游离IR808的荧光强度降至初始值的10%左右，而HSA-IR808仍保持75%以上的荧光强度（图1e），表明其光稳定性显著改善。综上，白蛋白封装可有效提升近红外染料荧光亮度与光稳定性。接着研究者进一步探究了白蛋白封装对菁染料单线态氧生成及光动力治疗效果的影响。采用单线态氧荧光探针（SOSG）检测发现，在808 nm激光照射下，HSA-IR808溶液中的SOSG荧光强度在120秒内显著增强（图1f），表明封装染料能有效产生单线态氧；而游离IR808和ICG溶液中的SOSG荧光仅微弱增加（图1g、1h），PBS对照组则无变化。定量分析显示，白蛋白封装使单线态氧生成效率提升至游离IR808的3倍（图1i），其量子产率达到约0.5%。

尽管白蛋白封装能显著提升荧光团的亮度、稳定性和单线态氧生成能力，但天然白蛋白载体在体内常面临肿瘤靶向性不足的挑战。前期开发的抗CD47纳米抗体-白蛋白结合域融合蛋白（Nb-ABD）能通过结合白蛋白延长纳米抗体的体内半衰期，其对多种白蛋白亚型均表现出强结合亲和力，其中对人血清白蛋白（HSA）的亲和力最高。本研究利用这一特性，通过Nb-ABD与HSA-IR808分子的自组装构建纳米抗体-白蛋白平台（Nb-HSA-IR808）（图2a）。采用分子排阻色谱（SEC）分析1:1摩尔比的Nb-ABD与HSA复合情况，结果显示在50 mL保留体积处出现单一蛋白峰（图2b），其分子量大于游离HSA；而2:1混合体系则同时存在Nb-HSA复合物和游离Nb-ABD。稳定性实验表明，Nb-HSA复合物在PBS或50%胎牛血清（FBS）中37℃孵育48小时后，PBS组保持完全复合状态，50% FBS组复合率仍超过90%（图2c）。动态光散射（DLS）检测显示Nb-HSA复合物粒径较游离HSA略有增大（图2d），与SEC结果一致，证实该平台具有高效自组装性、产物均一性和生理环境稳定性。

图3. Nb-HSA-IR808探针的体外细胞光毒性测定

研究者随后通过将癌细胞与IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808共培养，评估了纳米抗体-白蛋白探针的光动力效应。在无光照条件下，三种探针在0-20 μM浓度范围内均未表现出显著细胞毒性（图3a）。但经808 nm激光照射10分钟后，观察到明显的浓度依赖性光毒性效应（图3b）。当浓度超过10 μM时，Nb-HSA-IR808处理组的光毒性显著高于游离IR808或HSA-IR808组，证实纳米抗体靶向作用增强了光动力疗效。活/死细胞染色结果与细胞活性检测一致：无光照时各组细胞均保持高活性（图3c）；激光照射后，Nb-HSA-IR808组显示出最强烈的死细胞信号。PBS对照组在光照后仍维持高细胞存活率，排除了实验所用激光剂量本身的细胞毒性。结果共同证明，Nb-HSA-IR808探针在光动力治疗领域具有重要应用潜力。

图4. Nb-HSA探针的体内生物分布和药代动力学

由于分子量较小，游离纳米抗体易通过肾脏快速清除，导致体内循环时间较短（51,52）。研究者通过小鼠模型研究了纳米抗体-白蛋白平台的药代动力学和生物分布特性。首先采用Cy5.5-NHS酯标记Nb-ABD蛋白并组装成Nb-Cy5.5-HSA探针。活体荧光成像显示（图4a），静脉注射Nb-Cy5.5-HSA的小鼠在5分钟内即出现明显的肝脏富集，而游离Nb-Cy5.5主要蓄积于膀胱区域。定量分析表明，注射后6小时内Nb-Cy5.5-HSA组的肝脏信号强度显著高于游离纳米抗体组（图4b、4c）。离体器官成像进一步证实，注射6小时后Nb-Cy5.5-HSA主要分布于肝脏，而游离纳米抗体则集中于肾脏（图4d、4e）。药代动力学监测显示，HSA结合使纳米抗体的血浆半衰期从0.2小时延长至1.5小时，增幅达7.5倍（图4f）。这些结果共同表明，白蛋白结合通过将纳米抗体的清除途径从肾脏快速排泄转为肝脏代谢，显著延长了其体内循环时间。

图5. 皮下LS174T肿瘤小鼠的荧光成像

本研究采用结直肠癌异种移植小鼠模型，评估了Nb-HSA-IR808探针的体内肿瘤靶向能力。在静脉注射等染料浓度的IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808探针后，对荷瘤小鼠进行了24小时近红外二区（NIR-II）荧光成像监测。如图5a所示，三组动物的肿瘤部位荧光信号在12小时内持续增强，并在24小时内保持相对稳定。值得注意的是，Nb-HSA-IR808组的肿瘤信号强度较游离IR808和HSA-IR808组提高1.5倍（图5b）。HSA-IR808与游离IR808在肿瘤部位的信号强度相近，可能与血液中内源性白蛋白对IR808的包裹作用有关。Nb-HSA-IR808组的肿瘤-肌肉信号比值较其他两组高出1.6倍以上（图5c），凸显了该探针在荧光引导光动力治疗中优异的NIR-II成像对比度。离体器官成像显示（图5d、5e），三种探针在主要脏器的分布相似，但Nb-HSA-IR808在肿瘤组织的信号强度比游离IR808和HSA-IR808高约1.6倍。尤为重要的是，Nb-HSA-IR808组肿瘤的荧光信号甚至超过肝脏、肾脏等清除器官，充分证明纳米抗体-白蛋白平台卓越的肿瘤靶向性能。肿瘤组织的免疫组化结果（图5f）显示CD47高表达，为纳米抗体探针的高靶向特异性提供了分子基础。

图6. Nb-HSA-IR808探针体内抗肿瘤疗效评价

本文在结直肠癌异种移植模型中评估了Nb-HSA-IR808探针的光动力治疗效果。将5×106个LS174T细胞皮下接种至每只Balb/c裸鼠体内，待肿瘤体积达到约80 mm³时，将小鼠随机分为五组，分别静脉注射游离IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808探针（400 μM IR808当量剂量，100μL）。注射12小时后，使用808 nm激光（0.7 W/cm²）照射肿瘤部位10分钟（图6a）。治疗过程中实时监测肿瘤部位温度，始终维持在42℃以下以避免潜在的光热效应（温度超过42℃通常会造成不可逆组织损伤）。如图6b所示，PBS组和游离IR808组在激光照射下均未显示肿瘤抑制效果；未接受光照的Nb-HSA-IR808组与PBS组及游离IR808组肿瘤生长曲线相似，证实探针本身无抑瘤作用。而Nb-HSA-IR808联合激光照射组展现出最显著的治疗效果——单次静脉注射后仅需10分钟近红外光照射（0.7 W/cm²），14天内肿瘤体积较对照组缩小82%。值得注意的是，非靶向的HSA-IR808组仅表现中等抑瘤效果，凸显了纳米抗体靶向对疗效的提升作用。离体肿瘤照片（图6c）显示Nb-HSA-IR808+激光组的肿瘤体积最小，平均重量仅为PBS+激光组的22%（图6d）。该组小鼠14天存活率保持100%（图6e），且所有组别小鼠体重均无显著变化（图6f），证实探针系统毒性极低。这些结果证明：白蛋白增强的单线态氧生成与纳米抗体介导的肿瘤靶向具有协同增效作用，使Nb-HSA-IR808能以更低辐射剂量（420 J/cm²，远低于文献报道的600 J/cm²以上）实现优异疗效，展现出显著的临床转化潜力。

研究者对各组小鼠肿瘤组织进行了病理学分析。H&E染色和免疫荧光结果显示（图6g），Nb-HSA-IR808联合激光照射组的肿瘤切片呈现最显著的坏死区域和强烈的细胞凋亡信号，证实该探针通过光动力效应有效诱导肿瘤细胞凋亡。为评估Nb-HSA-IR808的肾毒性风险，研究者检测了注射前后小鼠血清尿素和肌酐水平。结果显示：Nb-HSA-IR808组与PBS组在注射后72小时内各项指标均保持正常范围（尿素：3.2-13.2 mmol/L；肌酐：11-28 μmol/L），证实该探针不会引发可检测的肾损伤。综上所述，Nb-HSA-IR808探针所有组分（纳米抗体、白蛋白、IR808）均具有临床使用基础，使其成为兼具精准靶向能力、高效光动力活性和优良生物安全性的诊疗一体化平台。

参考文献

Yang, Y.; Zhang, Y.; Zhou, S.; Fang, X.; Zhang, X.; Wei, W.; Huang, G.; Wu, C., Self-Assembled Nanobody-Albumin Platform with Dye Encapsulation for NIR-II Imaging-Guided Photodynamic Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces 2025,17 (31), 44249-44262.

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