本研究由Pauline Hélie-Legoupil、Florencia Kloster等共同主导的论文《In vivo imaging of the barrier properties of the glia limitans during health and neuroinflammation》于2025年10月在《Nature Communications》期刊正式发表。

重要发现
01胶质界膜报告小鼠的构建与验证
基因编辑策略与蛋白定位
研究团队基于AQP4在星形胶质细胞脚板高度极性化表达的特性，将mRuby3序列插入Aqp4基因 exon 2的Val141和Val142之间，构建了AQP4-mRuby3融合蛋白。该设计采用GGGS重复序列作为柔性连接肽，确保荧光蛋白正确折叠且不影响AQP4形成四聚体或更高级的OAPs结构。通过免疫荧光共定位实验，在脑皮质和脊髓的血管周星形胶质细胞脚板及表面胶质界膜中均验证了融合蛋白与内源性AQP4的共定位。

生理功能完整性评估
为评估报告基因对水通道功能的影响，团队比较了野生型、杂合子和纯合子小鼠脑组织含水量。发现纯合子小鼠脑含水量轻微增加，而杂合子小鼠与野生型无显著差异。在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，杂合子小鼠的发病进程、脊髓含水量及脾细胞增殖反应均未受影响，证明AQP4-mRuby3融合蛋白不影响神经炎症进程。电镜分析进一步显示杂合子小鼠星形胶质细胞脚板超微结构正常，三类形态学评分（正常、轻度肿胀、明显肿胀）与野生型无统计学差异。

02多光子活体成像技术的突破
双光子激发波长优化
研究采用1045 nm激发波长可高效激发mRuby3信号，同时产生胶原纤维的二次谐波信号（SHG）。通过颅窗、薄化颅骨和脊髓窗手术制备，实现了对大脑皮质表面和脊髓胶质界膜的三维动态观测。表面胶质界膜的AQP4-mRuby3信号呈弥散分布，而血管周胶质界膜则呈现高度极化的亮信号，这与星形胶质细胞形态差异相符。

中枢神经系统边界报告系统
将Aqp4-mRuby3小鼠与VE-cadherin-GFP小鼠杂交，构建了可同步显示胶质界膜、血管内皮和软脑膜边界的报告系统。采用双波长激发（920 nm和1045 nm）策略，解决了不同荧光蛋白最佳激发谱差异的难题。该模型清晰展示了血管深入实质时胶质界膜从表面到血管周的漏斗状过渡结构，为界定血管周空间提供了精确标志。

免疫细胞行为追踪
在CX3CR1-GFP/Aqp4-mRuby3双报告小鼠中，根据细胞与胶质界膜的相对位置可清晰区分边界相关巨噬细胞（位于界膜上方）与小胶质细胞（位于界膜下方）。表面胶质界膜上的BAMs呈阿米巴样形态，而实质内小胶质细胞则呈现高度动态的细长突起。

CD8+ T细胞监视与侵袭模式
在ODC-OVA小鼠模型中，OVA特异性CD8+ T细胞在免疫监视状态下主要停留于边界区，而抗原识别后则大量穿越胶质界膜进入实质。轨迹分析显示实质内T细胞位移距离和运动速度显著高于边界区细胞，且在神经炎症状态下整体运动性下降。

创新与亮点
01技术突破：首例胶质界膜在体成像模型
本研究首创的Aqp4-mRuby3报告小鼠解决了长期以来无法直接观测胶质界膜动态的难题。通过精准的基因编辑设计，将荧光蛋白插入AQP4第二胞外环，既保留了蛋白功能又实现了高信噪比标记。相较于传统免疫组化或体外培养模型，该技术首次实现了在生理条件下对胶质界膜屏障功能的连续观测。

总结与展望
Aqp4-mRuby3报告小鼠模型的成功开发为神经免疫研究领域提供了强大工具，使科学家首次能够在活体动物中直观观察胶质界膜的动态屏障功能。该技术不仅证实了胶质界膜在维持中枢神经系统免疫特权中的关键作用，还揭示了免疫细胞穿越不同边界区的分子机制差异。未来这一模型可进一步与疾病模型小鼠结合，用于研究多发性硬化、脑水肿、神经退行性疾病等病理过程中胶质界膜的功能演变。此外，该技术平台为筛选靶向胶质界膜的药物提供了新型评估手段，有望推动神经免疫疾病治疗策略的创新发展。随着精准基因编辑技术的进步，未来或可开发出能够实时反映胶质界膜通透性变化的智能报告系统，为最终揭示中枢神经系统免疫调控的奥秘开辟新途径。

DOI:10.1038/s41467-025-63945-7.