4.9微米空间分辨率宽场荧光显微镜用于定位追踪小鼠脑皮层血管成像
2025-10-22 来源:本站 点击次数:44本研究的核心贡献者包括Quanyu Zhou、Claim Glück、Lin Tang、Lukas Glandorf、Jeanne Droux、Mohamad El Amki、Susanne Wegener、Bruno Weber、Daniel Razansky和Zhenyue Chen。他们的合作成果以题为“Cortex-wide transcranial localization microscopy with fluorescently labeled red blood cells”的论文形式，在《Nature Communications》期刊上在线发表。
重要发现
01技术原理与系统设计
本研究的核心是红细胞辅助的宽场荧光定位显微镜技术，其基础在于利用宽场荧光显微镜系统对稀疏标记的荧光红细胞进行连续定位和跟踪。系统采用典型的epi-荧光配置，集成660纳米和488纳米两个连续波激光源作为激发光源，分别用于DiD标记的红细胞和GCaMP钙指示剂的成像。检测部分则配备高速sCMOS相机，帧率最高可达833赫兹，确保能够捕获快速血流动态。光学路径中通过二向色镜分离激发和发射光，并结合带通滤光片优化信号采集。这种设计使得系统能够在横向视野覆盖整个小鼠皮层的同时，保持微米级空间分辨率和亚秒级时间分辨率。
红细胞标记过程采用DiD荧光染料，通过离体染色和纯化，确保标记细胞在血液循环中保持长寿命（可达数十分钟）。注入小鼠体内后，稀疏的红细胞分布使得系统能够通过定位算法逐个追踪细胞运动。成像重建过程包括三个关键步骤：首先利用小波滤波和高斯拟合进行发射体定位，获取亚像素精度的位置信息；然后应用u-track算法跟踪红细胞轨迹，计算血流速度和方向；最后通过叠加轨迹生成高分辨率血管结构图和功能参数图。实验验证表明，该系统能够区分间隔仅4.9微米的相邻血管，并探测到大脑表面下200微米深处的血管，证实了其卓越的成像深度和分辨率。
02实验过程与成像应用
在功能成像实验中，研究团队对麻醉小鼠施加后爪或胡须电刺激，以激发神经血管响应。成像序列以400赫兹帧率记录，通过定位重建生成有效帧率为1赫兹的功能图。例如，在后爪刺激实验中，系统成功渲染了皮层血管的超分辨结构图，并通过计算血流时间序列与刺激模式的皮尔逊相关系数，生成了血流速度激活图。这些图像清晰显示了刺激引发的血流增加区域，且激活强度在毛细血管中高于动脉和静脉，表明微循环在功能亢进中起关键作用。
同时，通过集成488纳米通道的GCaMP钙成像，系统实现了神经活动与血流动力学的同步记录。在Thy1-GCaMP6f转基因小鼠中，刺激后GCaMP激活图与血流速度激活图显示出空间共定位，证实了神经血管耦合的存在。定量分析显示，位于神经激活区域内的血管段血流增加幅度（7.5±1.0%）显著高于区域外（3.5±0.6%），且血流响应沿血管树从高阶分支向低阶分支传递时，激活强度递增而响应时间递减。这一发现提示血流调控可能源于高阶血管的主动调节。
在跨颅成像实验中，系统通过调整放大倍率至0.86，实现了整个皮层的覆盖。尽管颅骨引入的光子散射降低了信噪比，但技术仍能检测到直径小至15微米的血管激活。双侧后爪刺激实验揭示了大脑偏侧化响应：刺激对侧半球的血流变化更显著，尤其是静脉的激活强度（7.9±1.6%）高于同侧（3.8±0.6%），而动脉响应则相对均衡。这展示了技术在研究大脑半球间差异方面的潜力。
03光学与成像技术细节从光学角度看，该技术的优势源于宽场照明的并行性，避免了扫描显微镜的视野限制。定位精度依赖于系统的信噪比和空间采样率，通过高速相机和优化算法，实现了对红细胞运动的高精度追踪。此外，DiD染料的深红色发射光增强了组织穿透能力，而长循环寿命的红细胞确保了成像的稳定性和可重复性。与现有方法如双光子显微镜相比，本技术无需逐点扫描，从而能够同时捕获全视野动态，特别适合大尺度功能成像。
创新与亮点
01突破现有成像难题
本研究突破了传统神经成像技术的多个瓶颈。例如，双光子显微镜虽能提供细胞级分辨率，但视野狭窄（通常小于1毫米）且扫描速度慢，难以实时追踪全皮层血流；功能磁共振成像虽具非侵入性，但空间分辨率低且无法直接测量血流参数。红细胞辅助的WFLM技术成功融合了大视野、高分辨率和快速成像的优势，首次实现了在毛细血管水平进行皮层范围的功能性血管成像，解决了神经血管耦合研究中时空特征不明确的难题。
技术的创新点在于将荧光定位显微镜与生理相容的红细胞标记相结合。通过稀疏标记策略，系统能够区分单个红细胞，从而精确计算血流速度、方向和流量等多参数。这种多参数读数能力是现有技术如激光散斑对比成像或功能超声所缺乏的。此外，技术的简单光学设计使其易于与其他模态（如钙成像）集成，实现了真正的同步神经血管记录。实验中的脉冲流分析显示，系统能捕捉到与心率一致的血流波动（约4.6赫兹），验证了其动态监测的可靠性。
03应用价值与推广潜力
该技术的价值体现在其多功能性和转化潜力上。在基础研究中，它能够解密刺激诱发的血流调控机制，例如发现动脉血管扩张早于毛细血管，提示动脉在血流体积调节中起主导作用。在临床前模型中，技术有望用于研究中风或神经退行性疾病中的微循环障碍。此外，其跨颅成像能力减少了对侵入性颅窗手术的依赖，降低了实验复杂性。未来，通过结合近红外二区荧光染料或自适应光学，技术还可进一步提升穿透深度和分辨率。
总结与展望
本研究开发的红细胞辅助宽场荧光定位显微镜技术，为大脑微循环成像设立了新标准。通过实现皮层范围的高分辨率神经血管同步记录，技术不仅增进了对神经血管耦合的理解，还展示了在感觉刺激下血流动态的精细调控。创新性地利用红细胞作为天然示踪剂，确保了成像的生理相关性和长时间稳定性。展望未来，该技术可通过多视角检测策略增加三维信息，或整合功能磁共振成像等模态，进一步解密血流参数对氧合信号的影响。此外，在疾病模型中应用该技术，有望揭示微循环功能障碍的新机制，推动脑疾病诊疗策略的发展。总体而言，这项技术将成为神经科学工具箱中的重要组成部分，为解密大脑奥秘提供强大支持。
论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Zhou Q, Glück C, Tang L, Glandorf L, Droux J, El Amki M, Wegener S, Weber B, Razansky D, Chen Z. Cortex-wide transcranial localization microscopy with fluorescently labeled red blood cells. Nat Commun. 2024 Apr 25;15(1):3526.
DOI:10.1038/s41467-024-47892-3.