本研究的核心贡献来自Naoki Honkura、Mark Richards、Barbara Lavina、Miguel Sainz-Jaspeado、Christer Betsholtz和Lena Claesson-Welsh等研究者。他们共同发表的论文题为“Intravital imaging-based analysis tools for vessel identification and assessment of concurrent dynamic vascular events”，发表在《Nature Communications》期刊。该研究通过高分辨率活体成像技术，揭示了血管在刺激下的动态响应特性，为血管生物学提供了重要见解。

重要发现
01血管类型识别与分类 
血管系统包括小动脉、毛细血管和小静脉等不同类型，它们对刺激的响应存在显著差异。传统上，血管类型可通过直径区分：小动脉和小静脉直径通常≥10微米，毛细血管≤10微米。在耳部皮肤微血管系统中，血管类型的分布约为9%的小动脉、75%的毛细血管和16%的小静脉。然而，皮肤血管的随机排列使得相似管径的小动脉和小静脉难以区分。为解决这一问题，研究采用了荧光右旋糖酐的分布动力学分析。通过尾静脉注射2000 kDa FITC-右旋糖酐后，利用单光子时间推移成像观察其分布：小动脉在10秒内首先显影，随后是毛细血管，最后是小静脉和静脉。这种分布模式可通过热图可视化，清晰区分不同血管类型。

血流速度是另一个关键参数。通过红细胞运动速度测量，小动脉的血流速度超过100微米/秒，而小静脉和毛细血管均低于100微米/秒。结合直径和流速，可准确识别血管类型。此外，紧密连接蛋白Claudin5（Cldn5）的表达模式进一步细化了血管分类。免疫染色显示，Cldn5在小动脉和部分毛细血管中表达，而小静脉表达缺失。利用Cldn5启动子驱动GFP表达的转基因小鼠模型（Cldn5(BAC)-GFP），可直接在活体成像中观察Cldn5表达：GFP阳性区域包括小动脉和部分毛细血管（称为阳性毛细血管），而混合表达或无表达的毛细血管段以及小静脉则显示低或无GFP。这种表达模式与内源性Cldn5分布一致，为血管功能研究提供了分子基础。

验证实验显示，RVDM与XT和fXYT成像的流速估计结果高度一致，尤其在流速超过20微米/秒时。RVDM的误差范围在5-15%之间，与传统方法相当。该工具还可生成整个血管网络的速度图，清晰显示血管分叉和交汇处的流速变化。RVDM的优势在于仅需单帧图像即可计算所有血管的流速，且兼容sXYT成像，允许在记录其他血管事件（如泄漏或扩张）的同时进行血流测量。工具通过软件实现，用户可输入扫描参数和红细胞尺寸，自动计算流速，避免了人为偏差。

泄漏动力学分析显示，VEGFA注射后约2分钟内开始泄漏（滞后期），随后荧光强度在血管外增加，6-12分钟后逐渐停止（泄漏持续时间）。小分子（如70 kDa菲科尔）的泄漏持续时间较长（约12分钟），而大分子（如2000 kDa右旋糖酐）在小静脉中仅泄漏6分钟。血管扩张与泄漏同步发生：小静脉直径增加不到1.7倍，而毛细血管扩张显著，5分钟内增加三倍，且30分钟后仍未完全恢复。血流方面，VEGFA导致小静脉和毛细血管的血流速度显著降低，尤以毛细血管为甚。这些变化表明，VEGFA通过影响血管张力和血流，调控微环境动态。

创新与亮点
01突破的技术难题
传统血管成像技术如RVFS需多角度扫描，无法兼容并发动态事件的记录。RVDM工具通过单帧图像分析红细胞变形，解决了这一难题，实现了大视野下所有血管流速的同步测量。此外，非侵入性皮内刺激方法避免了复杂手术（如颅窗植入）可能引发的炎症反应，确保了血管响应的真实性。这些创新克服了以往技术对高速采集的依赖，为研究快速血管事件提供了可靠平台。

总结与展望
本研究通过非侵入性多光子显微镜和RVDM分析工具，系统揭示了血管在VEGFA刺激下的动态响应。技术层面，RVDM实现了流速、泄漏和扩张的同步量化，突破了传统方法的局限；生物学层面，发现了Cldn5表达与血管功能的相关性，为靶向治疗提供了新靶点。未来，该技术可应用于炎症、肿瘤等病理模型，探索血管在疾病中的特异性变化。同时，通过优化成像参数，RVDM可适应不同血管床的流速范围，进一步拓展其应用场景。总之，这项研究不仅推动了血管生物学的技术进步，也为临床转化奠定了坚实基础。

DOI:10.1038/s41467-018-04929-8.