1. 借助扫描电镜直观观察细胞形态，判断是否出现细胞焦亡特有的肿胀、细胞膜穿孔等典型形态特征；
2. 通过 TUNEL 染色检测细胞内 DNA 片段化情况，辅助鉴别细胞死亡是否伴随焦亡相关的核酸损伤特征；
3. 采用免疫荧光染色技术（LabEx可提供检测服务），针对 GSDMD 或 GSDME 蛋白进行标记，观察其在细胞内的表达定位，明确焦亡关键效应蛋白的激活与分布状态。

（2）焦亡相关蛋白检测

1. 采用 qPCR 技术或 Western Blot 技术，分别从基因转录水平和蛋白表达水平，检测与细胞焦亡相关的基因或蛋白的表达量，以此判断焦亡通路是否被激活，LabEx提供升级版wb=抗体芯片技术，可一次性检测几十个信号通路关键蛋白；
2. 通过 ELISA 试剂盒特异性捕获样本中的 IL-1β、IL-18 等炎症因子，定量检测其水平变化，为细胞焦亡过程中炎症反应的激活提供直接依据，LabEx提供Luminex、MSD等多因子检测技术，可在一份样本中检测十几、几十种关键因子指标；
3. 利用 MTT 法或 CCK-8 法，通过检测细胞对试剂的代谢活性，间接测定细胞活力，辅助判断细胞是否因焦亡发生死亡及死亡程度。

3、细胞焦亡的关键调控分子有哪些？
（1）GSDMs
Gasdermins（GSDMs）蛋白是介导细胞焦亡的关键效应分子，目前已知人类 GSDM 基因家族包含 6 个成员，分别为 GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME 与 DFNB59。在这 6 个成员中，除 DFNB59 外，其余所有 GSDMs 蛋白均由两个功能不同的结构域构成：一是 C 末端抑制结构域（Regulatory Domain, RD，简称 CT），二是 N 末端效应结构域（Pore-Forming Domain, PFD，简称 NT），其中 NT 结构域具备细胞毒性。当 RD 结构域被水解去除后，游离的 PFD 结构域可与细胞膜上的脂质组分结合，进而在细胞膜上形成孔洞，启动细胞焦亡过程。

   

现阶段，GSDMs 家族中仅 GSDMD 诱导细胞焦亡的机制已明确，这也是公认的细胞焦亡经典途径。其具体过程为：当细菌、病毒等信号作用于细胞时，胞内模式识别受体（NLR）识别信号后，通过接头蛋白 ASC 与 caspase-1 前体结合形成多蛋白复合物，激活 caspase-1；活化的 caspase-1 一方面切割 GSDMD 产生 GSDM-NT 活性肽段，诱导细胞膜穿孔、细胞破裂并释放内容物以触发炎症，另一方面切割 IL-1β、IL-18 前体生成活性形式，释放后募集炎症细胞扩大炎症反应。

但研究发现存在例外情况：巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞中，部分细胞在炎性小体激活导致 GSDMD 裂解后，并未发生膜破裂与焦亡，反而能够存活，这类细胞被定义为 “超活化细胞”。由于超活化细胞可分泌更多炎性介质，而乳酸脱氢酶（LDH）的释放量与细胞膜完整性相关（焦亡细胞膜破裂会释放大量 LDH，超活化细胞则不会），因此可通过检测细胞培养上清中 LDH 的水平，区分细胞是超活化状态还是发生了焦亡。然而，当前对于 GSDMD 裂解后为何会分别引发焦亡或超活化的具体调控机制，尚未得出明确结论。

参考文献：Channelling inflammation: gasdermins in physiology and disease.  2021 May;20(5):384-405. 

  

（2）Caspase-1

作为 IL-1β 转化酶（IL-1β converting enzyme），caspase-1 是由单核细胞合成的蛋白酶，其核心功能是介导 34kD 的 IL-1β 前体（pro-IL-1β）向 17kD 成熟 IL-1β 的剪切，且这一加工过程对 IL-1β 活性的发挥至关重要。具体表现为：不表达 caspase-1 的细胞系，在转入 IL-1β 基因后仅能产生 pro-IL-1β，无法分泌有活性的成熟 IL-1β；而 caspase-1 特异性抑制剂可成功阻断金黄色葡萄球菌刺激引起的 IL-1β 分泌。酶学特征方面，caspase-1 属于半胱氨酸蛋白酶，活性中心含高活性巯基，对氧化剂敏感，但不会被丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂所抑制。 

 

（3）NLRP3

炎症小体是细胞内的蛋白复合物，机体受刺激后，可在免疫细胞及非免疫细胞中出现。NOD 样受体（NOD-like receptor，NLR）相关炎症小体是人体固有免疫的重要组成部分，功能关键。NLR 家族的分类依据是炎症小体氨基末端的结构特征：含吡啶结构域（PYD）或半胱天冬酶激活和募集结构域（CARD），据此可分为 NLRP、NLRC 等亚家族。而由 NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NLRP3）构成的炎症小体，即为 NLRP3 炎症小体。

 

NLRP3 炎症小体的结构由三部分核心组件构成，分别是 NLRP3 蛋白、凋亡相关点样蛋白（apoptosis associated speck-like protein containing a CARD domain，简称 ASC），以及前半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 1（pro-caspase-1）。

人类 NLRP3 转录基因 cias1 定位于 1q44 号染色体；ASC 蛋白由 N 端热蛋白结构域与 C 端半胱天冬酶募集结构域（CARD）构成，其中 N 端可结合 NLRP3 受体蛋白，C 端能募集两个 pro-caspase-1 分子。NLRP3 炎症小体可被模式识别受体（PRR）激活，激活信号包括病原相关分子模式（PAMP）与危险相关分子模式（DAMP）。
 

经典激活途径中，NLRP3 在激酶 NEK7 作用下发生复合物分离，进而诱导 caspase-1 自动激活，随后在 NF-κB 参与下，proIL-1β 与 proIL-18 被切割激活；非经典途径则依赖 caspase-4、5、11，最终生成具生物活性的 IL-1β 与 IL-18。近期研究表明，两种途径中 GSDMD（gasdermin D）蛋白均起关键作用：它可诱导细胞膜穿孔，促进 IL-1β 与 IL-18 从胞质释放，同时也是细胞焦亡的核心蛋白。