文章来源公众号：生物快评         作者：生物快评

因为在水溶液中，人体的环境下，膜和膜融合不是天然发生的事情，需要克服膜周边水分子的排次作用，所以这样也给病毒和宿主细胞膜融合带来了另一个问题就是“感染入侵的问题”，这里需要进化出一套精密的“分子机器”，来完成病毒的膜和宿主细胞膜的融合。这些融合的完成需要依靠“配体-受体”作用来完成。

DOI:10.1016/j.bbamem.2016.02.007

病毒的蛋白质包括：
Gag: 这个gag是产生结构蛋白,gag这个名称怎么来的？一般在病毒学研究中，研究者对基因的命名充满了随意和简单直接，不像对人基因的命名要信达雅，这个鬼畜的缩写是group of antigen,意思是这个病毒蛋白主要激发人体产生抗体的，所以叫做“一组抗原”。

gag蛋白质产生MA/CA/NC。分别是MA: matrix蛋白，矩阵蛋白，结合包膜的作用，类似房屋的顶部支撑，。CA：capsid蛋白，包裹病毒粒子的作用，类似药物的胶囊壳。NC: nucleocapsid protein，NC是负责包裹病毒的核酸物质。最终通过

“俄罗斯套娃”一样的结构，得到封装好的HIV病毒粒子。

pol: pol蛋白是产生病毒的酶相关的蛋白：包括PR: 蛋白酶，RT：逆转录酶；IN: 整合酶（负责将DNA整合进入宿主基因组组）。

gp120和gp41，它们是一个复合体的两个部分，共同被称为包膜糖蛋白，是HIV病毒入侵人体细胞的“钥匙”，也是艾滋病药物和疫苗研究最重要的靶点之一。gp120：是暴露在外的“钩子”或“探头”，负责识别和初步结合目标细胞。gp41：是隐藏的“弹簧刀”或“锚”，负责膜融合，即刺穿细胞膜，让病毒核心进入细胞。

Rev：Rev is a transactivating protein that is essential to the regulation ofHIV-1 (and other lentiviral) protein expression。负责完整RNA从细胞核运输到细胞质中，完成病毒完整RNA和蛋白质的组装。

Tat: Trans-activator oftranscription（反式转录激活因子），大幅增强病毒基因的转录（将DNA模板转化为RNA的过程），没有Tat，HIV的复制效率会极低。

https://viralzone.expasy.org/5096

HIV病毒通过受体gp120结合受体CCR5、CD4之后，然后激动触发gp40暴露，gp40结构发生变化将gp40的疏水端插入到细胞膜上，介导病毒和细胞膜的融合。然后HIV capsid释放到了细胞质中，然后capsid经过激动蛋白结合并且在微管蛋白上运动，这样capsid运输到了核孔，最后向核孔内释放出病毒粒子中的酶和核酸。随后就发生了逆转录、整合等作用。

DOI 10.1074/jbc.M112.424432

HIV的gp160在病毒包装过程中经过宿主的蛋白酶水解得到gp120/gp41，两者是通过二硫键形成二聚体，然后在形成三聚体。Gp120糖基化程度高，且突变多，相当于亚稳态的gp41埋藏在gp120中，当gp120结合CD4\CCR5等分子后，gp41改变而结合细胞膜，最后膜融合，病毒进入细胞。

Viruses 2024, 16(12), 1933; https://doi.org/10.3390/v16121933

再看VSV病毒通过G蛋白结合LDL-R，因为LDL-R天然的作用是结合脂蛋白，结合之后LDL-R和脂蛋白一起通过钙网蛋白被内吞，这样细胞就完成了脂质的摄入；VSV病毒的G蛋白就利用这个“运输的后门”，VSV的G蛋白结合LDL-R之后，细胞内吞进入endosome，VSV病毒进入到endosome中激发endosome中的质子泵而endosome提高了H+浓度，即pH下降。Endosome进一步转为lysosome，因为pH的下降，VSVG蛋白中一些组氨酸在pH中电荷改变导致VSVG结构变化，然后VSVG的疏水端暴露出来结合到lysosome的膜上，类似VSVG在lysosome中“撕开”膜，VSV病毒粒子释放到了细胞质中，随后VSV释放遗传物质，随后整个遗传物质复制、RNA的复制、转录，病毒组装均在细胞质中。

https://doi.org/10.1073/pnas.1618883114

目前慢病毒都将gp120/gp41复合物换成了VSV的病毒的包膜，那么这种改变其实除了改变HIV的靶向性，也改变了病毒的生命周期中的路径。

我们利用VSV.G包装的慢病毒通过逃逸endosome之后，慢病毒capsid依然比较完整，还可以接着依靠Dynein完成运输到细胞核。设想一下，如果VSV.G的融合逃逸能力和融合速度不足够，响应pH下降的速度较慢，那么慢病毒的capsid则会在lysosome中无法快速逃逸，最终LV壳就会破坏而进入不了细胞核。

2nd vs 3rd Generation Lentiviral Systems

通过上面的对比，我们可以发现，核心区别2nd慢病毒需要TAT，而3nd慢病毒不需要TAT；2^nd中的gag、pol、rev、tat在一个质粒，而3nd慢病毒体系中，gag\pol为同在一个质粒，而rev在一个质粒中。

那么这个Tat发挥了什么作用了呢？为什么3nd慢病毒就可以不依靠它了呢？

我们先来看看HIV 基因组是如何复制的？

https://viralzone.expasy.org/5061

这个图显示是HIV ssRNA，逆转录得到dsDNA的过程：

首选DNA->RNA转录，需要一个“引子”，比如真核生物转录所需要的引物酶（primase），病毒利用的是宿主的tRNA，tRNA结合到PBS上，tRNA充当了引物，从tRNA的5’-3’合成一段DNA，这段DNA和HIV的LTR的R-U5配对。

然后这个R-U5-tRNA的分子“跳跃”到HIV ssRNA的3’端继续依靠R配对，生成DNA，这里注意写到的RNA引物额外携带了新生的U5。新生的DNA和RNA形成DNA:RNA杂交链，随后RNA基本上被RNaseH降解，而在多聚嘧啶PPT剩余部分RNA充当引物，继续合成DNA，此时DNA携带了U3-R-U5，成为了完整的3‘LTR。随后这个DNA发生”跳跃”到HIV DNA的5‘端，通过形成PBS杂交DNA:DNA，继续得到dsDNA，此时dsDNA的两端都是完整的LTR。

然后我们要知道dsDNA如果整合到宿主基因组后，HIV的U5类似启动子来转录HIV DNA生成RNA。有两个问题：1）5‘LTR的U3启动HIV DNA 转录，但是3’ LTR的U3也会启动下游基因的转录，如果下游是抑癌基因则有风险。2）U3启动HIV DNA转录效率低下。

宿主依靠TAT提高转录水平：当病毒的DNA整合到宿主细胞的染色体后，细胞的转录机器（RNA聚合酶II）会开始读取病毒基因，合成病毒RNA。遇到“卡顿”：但在没有Tat的情况下，这个转录过程在病毒基因的起始阶段非常缓慢、低效，经常中途停止，只能产生非常短小的RNA片段。这就像一辆车刚启动就熄火，无法跑完全程。Tat蛋白会特异性结合到这些刚合成出来的、短小的病毒RNA的一个特殊区域，称为 TAR。Tat-TAR的结合就像一个“救援信号”，它会招募一大群宿主细胞的辅助因子（如P-TEFb）。这个复合体（Tat + TAR + 宿主因子）能极大地提升RNA聚合酶的“工作效率”。

 举例子：

HIV野生型的基因组ssRNA结构

这里需要特别注意R-U5，5端独特序列（Unique to the 5’ end）；U3-R中的3‘ 端独特序列（Unique to the 3’ end）。

当HIV基因组整合到宿主基因组后，前病毒就变成了宿主细胞的一部分(即DNA序列)。这时，dsDNA序列的5端是U3-R-U5-genome-U3-R-U5(见上HIV 基因组逆转录的示意图).

HIV整合后转录时，U3区域发挥转录激活启动子的作用：U3区域内包含了许多关键的调控序列，可以结合宿主细胞的转录因子（如NF-κB, SP1等），并且这个转录活性依然不足够，病毒自身的Tat蛋白（通过TAR元件，位于R区）。当这些因子结合到U3区域后，它们会招募细胞的RNA聚合酶II，启动病毒基因的转录。

Addgene的pWPT-GFP (Plasmid #12255)

这个是二代2nd病毒目的载体。5’LTR是完整的LTR(即U3-R-U5)，truncated 3’LTR(R-U5)缺少U3。如果这个载体进行慢病毒包装，那么就相当于HIV在宿主基因中转录出来ssRNA包装进入慢病毒中，ssRNA的结构是：R-U5-GOI(Gene of Interest)-R。在这个过程中，需要完全依靠包装载体自带的5’LTR的U3启动转录，所需需要加入TAT协助转录得到更多的ssRNA，提高病毒产量。

当这个ssRNA经过逆转录后得到dsRNA，其结构是：R-U5-GOI-R-U5。这样目的基因就依靠自身的启动子转录（比如这里的EF1A），而3’LTR并没有U3，所以也不会对下游基因产生激活转录。

Addgene的pLVpuro-CMV-N-EGFP(Plasmid #122848)

这个是二代3nd病毒目的载体。5’LTR是truncated LTR(即R-U5)，3’LTR(U3.truncated-R-U5)，根据生物过程，这个质粒转染进入细胞，因为5LTR缺少U3，他是无法转录出ssRNA的，那么怎么办呢？这里额外加入外源强启动子RSV-promoter等转录出的ssRNA。这个ssRNA的结构是R3-U5-GOI-U3.truncated-R，因为这个U3.truncated很短已经缺少激活能力，所有也不会激活下游基因。因为慢病毒的5’LTR已经缺少U3且用了外源强启动子, 那么自然也就不需要TAT了。

Rev是ssRNA转录后运输出细胞核的关键。

   Once inserted, the viral DNA can be transcribed as one long RNA molecule by the host cell’s RNA polymerase II. This transcript is then spliced in many different ways to produce more than 30 different species of mRNA, which in turn are translated into a variety of different proteins. In order to make progeny virus, entire unspliced viral transcripts must be exported from the nucleus to the cytosol, where they are packaged into viral capsids and serve as the viral genome.

  The block is overcome by a viral-coded protein (called Rev) that binds to a specific RNA sequence (called the Rev response element; RRE) located within a viral intron. The Rev protein interacts with a nuclear export receptor (Crm1), which directs the movement of viral RNAs through nuclear pores into the cytosol despite the presence of intron sequences.

慢病毒的VSV-G结合LDL-R通过内吞进入细胞，这个过程分解动作是：VSV-G结合LDL-R，然后病毒粒子在endosome里面通过VSV-G结构变化然促进病毒膜和endosome膜融合。慢病毒in vivo感染的原理核心是：对VSV-G的结合LDL-R的能力破坏，保留VSV-G融合能力。

靶向分子CD3、CD5、CD7等scFV、CD3 VHH可以独立表达在细胞上，病毒粒子出膜的时候自然携带了这些分子。

需要考虑的是：
1）靶向CD3的分子最好是能够激发CD3符合的内吞，尽量快速完成病毒粒子的内吞。
2）靶向CD3的抗体最好是能够温和或者较强激活T细胞，促进感染效率。
3）靶向CD3的抗体亲和力不需要很高，适中即可。因为病毒的出膜、感染等，高亲和力的靶向会感染病毒的感染路径，比如影响了病毒的endosome逃逸。​