近年来，mRNA 疫苗和 siRNA 药物等 RNA 疗法发展迅猛，取得了显著的临床进展，如 COVID-19 疫苗、Onpattro 和 Spinraza 等突破性药物的获批上市。然而，核酸药物在体内的高效递送仍是关键挑战。常用的脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）载体虽然具备易于生产和载药量高等优势，但仍受限于靶向性不足和免疫原性等问题。

细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）作为一种天然存在的细胞分泌囊泡，具备低免疫原性、良好的生物相容性和潜在的靶向性，被认为是理想的药物递送载体。有证据表明：相比于 LNPs，EVs 可以更安全和高效地递送核酸。然而，如何将治疗性核酸药物有效装载到 EVs 内部仍然是一个不小的挑战。通过对生产 EVs 的细胞系进行基因工程改造来装载蛋白质或核酸是一种广泛应用的方法，然而该方法在面对临床患者来源的 EVs 时适用性有限，且难以用于装载经化学修饰的核酸。另一方面，在 EVs 分离后进行载药的方法，如电穿孔和超声处理等，则可能对其结构和功能造成负面影响。

为了应对这些挑战，瑞士苏黎世联邦理工学院的研究团队在 Advanced Science 发表了题为“Loading of Extracellular Vesicles with Nucleic Acids via Hybridization with Non-Lamellar Liquid Crystalline Lipid Nanoparticles”的研究论文。本研究提出了使用非层状液晶脂质纳米颗粒（non-lamellar liquid crystalline lipid nanoparticles, LCNPs）与 EVs 自发杂交形成杂交细胞外囊泡（HEVs）的新策略，实现包括 siRNA、mRNA 和核酸适配体在内的多种核酸分子的高效装载，同时保持 EVs 的生物学功能。这一杂交体系的体外装载效率远高于它的“前辈”——LCNPs，有望进一步拓展至更广泛的细胞来源甚至实现产业化。

一、LCNPs 的制备与表征
研究人员采用可电离脂质 DLin-MC3-DMA（MC3）、辅助脂质 DOPE 和非离子表面活性剂 HS15 制备了非层状液晶脂质纳米颗粒（LCNPs）。通过小角 X 射线散射 (small-angle X-ray scattering, SAXS) 和冷冻透射电镜分析 LCNPs 的结构特性，发现 LCNPs 在 pH 5 时呈现反六角相（HII 相），而在 pH 7.4 时转变为更无序的非层状相（可能是反向胶束 L2 或海绵相 L3），表明 LCNPs 具有 pH 依赖性的结构转变行为（图 1）。

图1. LCNPs 的理化特征

二、HEVs 的形成与表征
研究人员从 3D 培养的间充质干细胞（MSCs）中分离 EVs，并依照 ISEV 指南建议的多种技术手段表征 EVs 的质量。随后，深入研究了 EVs 与 LCNPs 杂交形成 HEVs 的动力学。静态光散射（SLS）和动态光散射（DLS）的结果显示，EVs 与 LCNPs 混合后，颗粒浓度呈指数衰减，并在 30 min 后趋于稳定。同时，粒径在 30 min 内从 160 nm 增大至 190 nm 并趋于稳定，表明杂交过程迅速进行。冷冻透射电镜（cryo-TEM）直观地观察了杂交的过程，如图 2 所示，混合后 5 分钟内，半融合的 HEVs 已然出现；4 小时之后，几乎全部形成了完全融合的 HEVs，且 EV 膜蛋白依然分布于颗粒表面。此外，研究者还探究了温度和 pH 对杂交动力学的影响。结果表明，在 37℃ 时，杂交过程更为迅速；而在 4℃ 时，动力学显著减缓。在酸性条件下（pH ≤ 6）EVs 与 LCNPs 之间的相互作用更为强烈，导致粒径急剧增大，可能促使大聚集体的形成。

图2. cryo-TEM 成像观察 HEVs 的形成

进一步地，采用纳米流式检测技术（NanoFCM）在单颗粒水平上探究脂质纳米载体的拓扑结构如何影响其与 EV 的相互作用。研究人员选取三种不同类型的脂质纳米载体（LCNPs、DOPC-NPs 和 DOTMA-NPs），分别装载了荧光标记的小核酸（FAM-siRNA），并与 CellTrace Red 标记的 EVs 以 1:1 比例混合。NanoFCM 的结果显示，不同类型的 NPs 与 EVs 混合后，均形成了不同比例的双阳性亚群，证实 HEVs 的形成（图 3A 中以青绿色方框突出显示）。进一步分析双阳性颗粒计数相对于 CellTrace 群体的比例，发现在酸性条件下，与高度正电荷的纳米颗粒（如 LCNPs 或 DOTMA-NPs）形成的 HEVs，分别达到了 57% 和 53% 的最高共定位率。而在 pH 7.4 下，LCNPs 与 EVs 的相互作用效率降至 40%；相比之下，DOPC-NPs 与 EVs 的相互作用效率最低，仅为 12%（图 3B)。这表明 NPs 的表面电荷、脂质组成以及拓扑结构对其与 EVs 的相互作用均有显著影响。此外，研究人员通过不同类型的核酸载物（mRNA 和核酸适配体）来评估 HEVs 的形成，进一步验证 HEVs 平台装载多种类型的核酸分子的有效性和普适性。

图3. NanoFCM 分析不同条件下 HEVs 的形成

三、HEVs 的生物学特性
为了探究 EVs 膜蛋白是否存在于 HEVs 表面以及 LCNPs 是否倾向于与特定的 EVs 亚群相互作用，研究人员利用光流体平台的免疫亲和捕获和荧光显微技术进行评估。

研究人员选择了多种 EV 和 MSC 特征膜蛋白的抗体作为捕获探针，结果显示，EVs 和 HEVs 的膜蛋白表达谱没有显著差异，且呈现 CD26 >> CD73 > CD9 > CD63 > IgG 的相对趋势（图 4C）。此外，不同膜蛋白与核酸的共定位比例均在 30%~40% 之间，这个结果与 NanoFCM 的结果互相印证（图 4D）。这表明 LCNPs 与 EVs 的杂交过程是非特异性的，不偏好任何特定的 EV 亚群。

进一步地，对膜蛋白的生物活性及核酸载物的完整性进行了验证。酶活性实验没有发现 HEVs 的 CD73 和 CD26 酶活性与天然 EVs 有显著差异（图 4E, F)。此外，HEVs 的结构能够保护核酸载物免受降解。

图4. HEVs 生物学特性的综合表征

四、HEVs 的基因递送功能
研究人员以 HeLa 细胞作为模型，构建了稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）或荧光素酶（FLuc）的细胞株，进一步通过转染 siRNA 或 mRNA 的质粒以评估 HEVs 和 LCNPs 的基因沉默和基因表达效率。
1）在基因沉默实验中，装载 siGFP 的 HEVs 于低血清条件下可使 GFP 荧光强度降低约 75%，其沉默效率与商业转染试剂相当（图 5A）；即使在高血清条件下，经过 4 小时处理，装载 siGFP 的 HEVs 仍能显著降低 GFP 荧光强度约 15%（图 5B）。
2）在基因表达实验中，低血清条件下，装载 mRNA 的 HEVs 即使在较低 mRNA 剂量下仍可诱导较高的荧光素酶表达水平（图 5C）；而在高血清条件下，即便在较高的 mRNA 剂量下，该载体系统仍能实现显著增强的荧光素酶表达（图 5D）。

上述结果表明，HEVs 的体外基因沉默和基因表达效率均优于传统的 LCNPs。

图5. HEVs 在体外的基因沉默和基因表达效率

结论
本研究开发了一种新型非层状液晶脂质纳米颗粒与 EVs 的杂交策略，获得的杂交 EVs 成功实现了核酸的高效装载。这一策略在避免了传统方法对 EVs 结构影响的前提下，显著提高了核酸的装载效率，同时保留了 EVs 的生物活性。这一多功能平台展现了将各种治疗性药物装载到 EVs 中的巨大潜力，为开发基于 EV 的基因递送系统开辟了新的路径。

展 望
NanoFCM 凭借卓越的散射和荧光灵敏度，在单颗粒水平解析了 HEVs 的粒径分布、浓度、融合效率和膜蛋白表达等多维信息。这使得研究者能够精确监测 EVs 与 LCNPs 的杂交过程，并高效评估了多种非编码 RNA 分子（即 mRNA、siRNA 和核酸适配体）载入 EVs 的效率。NanoFCM 的单颗粒多参数表征能力为深入探究生物杂交载体平台提供了有力支持，进而推动基于 EVs 的基因递送系统的发展。