mRNA 因其诱导目标蛋白表达的能力，在个性化医疗和疫苗开发等领域展现出巨大的潜力。众所周知，mRNA 是一个带负电的生物大分子，无法自主穿透细胞膜，必须依赖递送系统才能发挥作用。脂质纳米颗粒已被证明是递送 mRNA 的理想载体，其制备主要依赖微流控乙醇稀释法。该方法虽然高效，却需要精确控制乙醇浓度、pH 梯度和混合速率等多种参数，且必须在颗粒形成过程中同步加入 mRNA。一旦 mRNA 序列发生变更，整个工艺流程往往需要重新优化，这一局限性严重阻碍了在个性化医疗场景中实现快速响应的能力。

为了简化 mRNA-LNPs 的制备过程，日本千叶大学联合东北大学、大阪大学研究团队近日在 Nano Letters 发表了题为“A post encapsulation method for the preparation of mRNA-LNPs via the nucleic acid bridged fusion of mRNA free LNPs”的研究论文。该研究开发了一种新型现货型 LNPs（LNPs (RtoU/Liq)），即通过后包封法（post-encapsulation method）将 mRNA 溶液与预先制备的空包的 LNPs（mRNA-free LNPs）混合，在温和条件下即可实现高效包封。此方法操作简单，无需复杂的设备。此外，与需要加热的“冻干即用型 LNPs”相比，该方法避免了加热对 mRNA 质量的潜在影响，为 mRNA 药物的开发提供高效且简便的解决方案。

一、后包封法的流程
后包封法的核心步骤包括：
1、制备空包的 LNPs：利用微流体混合技术将脂质溶液（乙醇中）与酸性缓冲液混合，形成空包的 LNPs。随后，通过超滤技术将缓冲液替换成 2-(N-morpholino) 乙磺酸（MES）/蔗糖缓冲液，调整 pH 值至 6.0。
2、配置 mRNA 溶液：将合成的 mRNA 溶解在 MES/蔗糖缓冲液中，调整 pH 值至 6.0。
3、混合封装：将 mRNA 溶液与空包的 LNPs 进行快速涡旋混合，随后在 37℃ 下孵育 5 分钟，以促进 mRNA 的吸附和 LNPs 的融合。
4、中和完成：加入 PBS 中和 pH 值，完成封装过程。

图1. 两种包封方法的示意图

二、后包封法的优化与评估
1、脂质组成的优化
LNP 的核心组分包括可电离脂质、PEG 脂质、磷脂和胆固醇。其中，可电离脂质通过静电作用与带负电荷的核酸（如 mRNA）结合，直接影响 mRNA 包封率。研究团队筛选了三种可电离脂质（DODAP、DLin-MC3-DMA 和 ssPalmO-Phe-P4C2），发现三种脂质在 pH≤6.0 时均能实现超过 70% 的包封率（encapsulation efficiency）。

此外，磷脂分子具有亲水头部和疏水尾部，参与构建 LNP 的稳定结构，可与胆固醇协同提升核酸的包封率。而胆固醇在 LNP 中起到调节膜流动性、稳定性和提高包封率的作用。实验发现，当胆固醇占比 20%-40% 且磷脂占比 7.5%-20% 时，包封率最高（图 2）。

图2. 脂质组分对包封率的影响

2、mRNA 桥连介导的 LNPs 的融合机制
本研究发现，后包封法（包封率超过 70%）会导致颗粒粒径显著增加至原尺寸的 1.27 到 1.78 倍（图 2H, I）。这种增幅远超单纯 mRNA 封装所能解释的范围，提示存在 LNPs 间的粒子融合。

为了验证此机制，研究团队利用纳米流式检测仪（NanoFCM）在单颗粒水平对 mRNA-LNPs 的粒径和 mRNA 装载率（loading ratio）进行分析。分别对传统乙醇稀释法（EtD）和后包封法（RtoU/Liq）制备的 mRNA-LNPs 进行脂质（DiD）和核酸（SYTO 9）双重标记，NanoFCM 结果显示，后包封法的 mRNA 装载率相比传统方法提升约 16%（图 3A-C）。此外，在后包封组中，包封后颗粒的粒径显著大于空包的 LNPs（图 3D），表明在后包封法制备过程中，mRNA 的包封过程中同步发生了颗粒粒径的增大。

为了进一步验证 LNPs 之间的融合，研究团队使用了荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer, FRET）：将 DiA（荧光供体）与 DiD（荧光受体）共同标记在空包 LNPs 的脂膜上，因二者距离非常接近，发生 FRET，导致 DiA 荧光变弱而 DiD 荧光增强；随后将双标记的空包 LNPs 与未标记的 LNPs 以 1:9 的比例混合，加入 mRNA 后，mRNA 通过静电作用介导“核酸桥连的 LNPs 融合”，原紧密相邻的 DiA 与 DiD 被未标记 LNPs 的脂质分子分隔，FRET 显著减弱，DiA 荧光恢复而 DiD 荧光减弱。结果显示，pH 6.0 条件下 mRNA 可桥接相邻 LNPs，高效触发颗粒间的融合（图 3E-G），从而同步提升包封率和颗粒粒径。

图3. mRNA 桥连介导的 LNPs 融合验证

3、LNPs/mRNA 摩尔比优化
接下来，在 pH 6.0 条件下考察 LNPs/mRNA 的摩尔比（L/R比）对后包封法包封率的影响。如图 4 所示，当 L/R 比低于 50 时，包封率显著下降；增加 mRNA 相对含量（即降低 L/R 比）会增强 FRET 消除效应并增大颗粒尺寸。进一步通过电泳分析 mRNA 状态，发现在 L/R 比为 100 的情况下，mRNA 包封率高达 81%，仅有 11% 的核酸被检测为游离 mRNA；而在 L/R 比为 25 的样品中，包封率降至 0%，62% 的核酸被检测为游离状态，剩余的 38% 在表面活性剂溶解颗粒后被释放。这一结果表明在低 L/R 比条件下，大部分未包封的 mRNA 以游离形式存在，另有部分 mRNA 可能仅吸附在 LNPs 脂质复合物表面而未被有效包裹。充分说明合适的 L/R 比对于 mRNA 高效吸附于 LNPs 表面并实现稳定封装至关重要。

图4. L/R 比对包封率的影响

4、混合条件的优化
混合条件对包封率也有显著影响。研究中比较了快速混合（涡旋混合）和慢速混合（轻柔移液）两种方法。结果表明，快速混合能够提高包封率，尤其是在高 L/R 比下。这是因为快速混合避免 mRNA 在 LNPs 表面的局部过载，从而避免 LNPs 表面过度吸附 mRNA，导致融合过程受阻。相反，慢速混合会导致 mRNA 局部浓度过高，阻碍颗粒融合进程。

综上所述，后包封法的效率由 pH 值、脂质组成、L/R 比及混合动力学协同调控。通过优化这些参数，可实现 mRNA 的高效包封，为开发高效、简便的 mRNA-LNPs 制备工艺提供了重要技术参数。

三、现货型 LNPs 的 mRNA 递送效率
接着研究团队对现货型 LNPs 递送 mRNA 的效率进行评估。研究团队分别采用经典乙醇法和后包封法制备了包封编码荧光素酶基因的 mRNA-LNPs，分别注射至小鼠体内，活体成像显示，两种类型的 mRNA-LNPs 在肝脏中均实现了超过 98% 的选择性基因表达（图 5B, C），这表明现货型 LNPs 在体内递送 mRNA 方面与传统方法效果高度一致。

此外，利用后包封法制备包封鸡卵清蛋白和新冠病毒刺突蛋白 mRNA 的 LNPs，经小鼠肌肉多次注射，诱导出强效且持久的 IgG 抗体应答（图 5E）。表明现货型 LNPs 可应用于 mRNA 疫苗的快速开发。

图5. 现货型 LNPs 的 mRNA 递送效率评估

总结与展望
本研究开发了一种基于现货型 LNPs 的 mRNA 包封新策略，通过核酸桥接融合的方式将 mRNA 高效封装到预先准备好的 LNPs 中，实现一步反应制备高质量的 mRNA-LNPs。此外，体内外实验证实，后包封法的基因递送效率与经典的乙醇稀释法相当。该方法操作简单，无需复杂的设备，且省去了传统冻干工艺的加热环节，保障了 mRNA 的质量。因此，后包封法为 mRNA 药物的开发提供了一种高效、简便的解决方案，具有广泛的应用前景，有助于加速 mRNA 治疗和疫苗开发。

图6. 后包封法工艺流程图

NanoFCM 凭借其超高的灵敏度和完善的解决方案，可在单颗粒水平对 mRNA-LNPs 的粒径分布和封装率进行评估。通过荧光标记，NanoFCM 能够精准区分装载 mRNA 的和空包的 LNPs 颗粒，从而精确计算封装率。同时，基于单颗粒的散射光强度分析粒径，发现成功包封 mRNA 后颗粒粒径显著增大，揭示 mRNA 封装与粒径增大紧密相关，为核酸桥接融合机制提供直接的证据，进一步验证了后包封法的高效性和可靠性，为优化封装条件提供了关键依据。