耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）引起的感染是医院获得性感染的主要原因之一，对公共卫生构成严重威胁。MRSA 引起的器官特异性感染尤其是菌血症及深部组织感染，其病死率高，其早期诊断与治疗监测一直是感染病领域的重大挑战。临床上 MRSA 的检测主要基于细菌分离株的表型和基因型特征。表型方法常用的细菌培养和药敏试验耗时长、灵敏度低，且仅能提供定性结果；基因型方法使用的分子诊断技术如聚合酶链式反应（PCR）和宏基因组学二代测序（mNGS）虽提升了检测速度和灵敏度，但仍存在样本要求高、稳定性差、无法实时反映感染状态和治疗效果等局限。因此，开发一种能够实现 MRSA 感染早期诊断、动态监测及预后评估的新方法迫在眉睫。

细菌来源的胞外囊泡（bacterial extracellular vesicles, BEVs）因其携带细菌特异性信息，可经体液无创获取以及稳定性高等特点，被视为理想的生物标志物来源。其中，青霉素结合蛋白 2a（PBP2a）作为由 mecA 基因编码的耐药性关键蛋白，介导 MRSA 对 β-内酰胺类药物的耐药性，具备高特异性、稳定性和与感染程度及治疗反应相关的特征，成为识别和监测 MRSA 感染的关键潜在蛋白标志物。因此，血浆中 PBP2a 阳性胞外囊泡（PBP2a⁺ EVs）有望成为 MRSA 感染的新型诊断和动态监测工具。然而，其精准检测仍面临技术瓶颈：BEVs 粒径多分布于 60-120 nm，常规流式细胞术灵敏度不足，难以检测到 200 nm 以下颗粒；电子显微镜可观察形貌却不适用于高通量定量分析，无法反映 EVs 的动态变化。

近日，上海交通大学医学院附属仁济医院联合四川大学华西第二医院和浙江省肿瘤医院的多学科团队在 Journal of Extracellular Vesicles 发表了最新研究成果，突破了上述技术限制。该研究利用单颗粒纳米检测术（NanoFCM）实现了血液中 PBP2a⁺ EVs 的高灵敏及高通量定量分析，并探索了其作为生物标志物区分 MRSA 和敏感金黄色葡萄球菌（methicillin sensitive Staphylococcus aureus, MSSA）感染的潜力。此外，通过系统性的动物模型和临床样本验证，揭示了 PBP2a⁺ EVs 在感染过程中的动态变化规律，为 MRSA 感染的早期诊断和治疗监测提供了新的方向。
 

一、MRS-EVs 的分离与表征
从不同克隆型 MRSA（包括ST5、ST398）、甲氧西林耐药表皮葡萄球菌（MRSE）和溶血葡萄球菌（MRSH）的培养上清中提取 BEVs，并通过透射电镜（TEM）确认其典型双层膜结构（图1a），NanoFCM 单颗粒分析显示 BEVs 粒径分布主要集中在 60-120 nm，峰值为 70 nm（图1b），符合细菌来源 EVs 的典型特征。Western blot 结果显示，MRSA、MRSE 以及 MRSH 来源 BEVs 中均有表达 PBP2a 蛋白，而 MSSA 和血浆来源 EVs 中未检测到 PBP2a 蛋白（图1c）；经免疫电镜进一步确认 PBP2a 蛋白分布于 MRSA EVs 表面（图1d, e）。最后，利用 NanoFCM 在单颗粒水平定量分析 PBP2a⁺ BEVs 的比例。结果显示，MRS 来源的 EVs 中超过 40% 为 PBP2a 阳性，而 MSSA、大肠杆菌以及健康对照组几乎检测不到 PBP2a⁺ BEVs（图1f）。这些结果证实 PBP2a 为 MRS 来源 EVs 的特异性标志物。
 

图1. MRS-EVs 的综合表征

二、PBP2a+ EVs 的细胞来源解析
为了探究血浆中 PBP2a⁺ EVs 的来源，研究团队通过链霉亲和素磁珠结合生物素化的 PBP2a 抗体，从 MRSA 血流感染患者血浆中捕获 PBP2a⁺ EVs。经 TEM 观测到完整的形态。同时，NanoFCM 结果显示捕获的 PBP2a⁺ EVs 纯度超 90%（图2c）；进一步利用 NanoFCM 检测人源性的 EV 经典标志物，发现 PBP2a⁺ EVs 表达经典标志物（CD63、CD81、CD9、CD11）的阳性率仅 3%-5%，显著低于健康人血浆 EVs （7%-21%，图2d）；WB 也仅检测出微量 TSG101（图2e）。上述结果表明，MRSA 血流感染患者血浆中的 PBP2a⁺ EVs 主要来源于细菌，其特异性不受血浆中其他细胞来源影响，可作为 MRSA 感染的潜在标志物。
 

图2. 血浆中 PBP2a⁺ EVs 细胞来源鉴定

三、感染进程中 PBP2a+ EVs 的动态变化
选取肺炎、脑膜炎、皮肤脓肿、血流感染 4 种 BALB/c 小鼠感染模型，以 MRSA（ST398 菌株）为研究对象，MSSA 感染组为对照，并在感染后 0-72 h 内多个时间点采集血液样本。利用 NanoFCM 分析 PBP2a⁺ EVs 比例，同时通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 C 反应蛋白（CRP）与白细胞介素-6（IL-6）等非特异性炎症标志物的水平，以验证 PBP2a⁺ EVs 与感染炎症的关联性。NanoFCM 结果显示，所有 MRSA 感染模型小鼠血浆中 PBP2a⁺ EVs 比例均显著高于 MSSA 感染对照组；MSSA 感染组几乎检测不到 PBP2a⁺ EVs，证明 PBP2a⁺ EVs 能够特异性辨别 MRSA 感染（图3a）。此外，在肺炎模型中，MRSA 感染后 6 h 即可检出 PBP2a⁺ EVs，早于传统炎症标志物的临床预警窗口；PBP2a⁺ EVs 比例随感染进展逐步升高，30 h 达到峰值，随后逐渐下降，该变化趋势与 CRP 和 IL-6 一致（图3c-e）。PBP2a⁺ EVs 直接关联 MRSA 耐药表型，较非特异性炎症标志物更能精准反映 MRSA 感染的真实进程。

图3. 小鼠肺炎模型中 PBP2a⁺ EVs 的动态变化

在皮肤感染继发菌血症模型中，小鼠局部皮肤感染 14 h 后血培养呈阳性，细菌菌落数随感染时间增加而增加（图4c）；而 NanoFCM 定量结果显示，PBP2a⁺ EVs 在感染 2–4 h 即开始上升，且随感染的进展持续上升（图4d）。此外，PBP2a⁺ EVs 的动态变化幅度远大于 CRP 与 IL-6（图4e, f）。上述结果表明 PBP2a⁺ EVs 能更灵敏地反映感染进展，且可作为细菌入血前的早期预警指标。
图4. 感染进展过程中小鼠血液中 PBP2a⁺ EVs 和炎症标志物的动态变化

四、治疗响应监测与临床验证
为深入探究抗生素治疗 MRSA 期间血液中 PBP2a⁺ EVs 的动态变化。研究团队采用小鼠肺炎模型，随机分为万古霉素治疗组和 PBS 对照组，在 MRSA 感染后 12-72 小时内多次检测血浆中 PBP2a⁺ EVs 的比例。结果显示万古霉素治疗组的血浆 PBP2a⁺ EVs 比例呈现逐渐下降趋势，72 h 时显著低于 PBS 对照组（图5g)。同时，治疗组血浆中炎症因子水平也明显降低（图5h, i)。此外，治疗组肺组织中 Ly6G 阳性信号（中性粒细胞浸润标志）减少，提示肺部炎症缓解，进一步证实 PBP2a⁺ EVs 水平变化可准确反映治疗效果。
 

图5. 治疗监测

为了探究 PBP2a⁺ EVs 在人类感染中的临床意义，研究团队收集健康对照者（n=20）以及 MRSA 感染患者（涵盖呼吸道感染、组织/分泌物感染、血流感染 3 个部位，每部位 20 例），同时纳入 20 例 MSSA 血流感染患者作为对照。免疫电镜直接观察到 MRSA 血流感染患者的血浆中存在 PBP2a⁺ EVs（图6b, c）；NanoFCM 定量显示，所有 MRSA 感染患者血样中 PBP2a⁺ EVs 比例均显著高于健康对照组及 MSSA 对照组，且在血流感染患者中最高（图6d）。进一步分析发现，MRSA 血流感染患者 CRP 水平显著高于局部感染患者，且 CRP 水平与 PBP2a⁺ EVs 含量呈正相关（图6e）；在连续监测中发现，随着感染缓解（体温下降、CRP 及白细胞计数降低），PBP2a⁺ EVs 水平也逐渐降低（图6f），其变化趋势与临床病情改善高度一致，可实时反映治疗响应。ROC 曲线分析表明，PBP2a⁺ EVs 诊断 MRSA 血流感染的 AUC 高达 0.9350，效能突出。此外，针对呼吸道感染（AUC=0.8025）和组织感染（AUC=0.8513）同样具备可靠的诊断能力（图6g），表明 PBP2a⁺ EVs 既能精准识别血流感染这类重症场景，也能覆盖局部感染诊断需求，为不同部位 MRSA 感染提供统一高效的检测指标。

图6. 临床患者中 PBP2a⁺ EVs 的诊断价值

研究意义
本研究首次系统阐释了血浆中 PBP2a⁺ EVs 作为 MRSA 感染早期诊断与治疗监测的双重价值。该策略突破了现有技术对 MRSA 耐药性只能定性检测的局限，实现耐药表型与感染严重程度的同步量化分析，具备快速、无创、高特异性的显著优势。同时，PBP2a⁺ EVs 能够动态反映抗生素治疗过程中病原体负荷的变化，为临床上制定个性化的精准治疗方案提供了客观依据，进而控制抗生素的使用，降低耐药菌的产生和传播。该研究不仅为开发基于 PBP2a⁺ EVs 的床旁快速检测技术以及多耐药因子联合检测策略提供了新思路，也为其他耐药菌的标志物挖掘与精准治疗奠定了重要基础。

NanoFCM 展望
在本研究中，NanoFCM 不仅具备超高散射和荧光灵敏度，更能保障检测结果的稳定性与可重现性，在此基础上实现了单颗粒水平对血浆中 PBP2a⁺ EVs 的高效表征，为开发基于 PBP2a⁺ EVs 的 MRSA 感染早期诊断与治疗监测提供了有力的支撑。未来可进一步基于 NanoFCM 技术开发适用于临床的快速检测平台，并将其推广至其他耐药菌及病原体来源 EVs 的特异性识别。NanoFCM 有望在感染病的早期预警、病情分级与个体化治疗中发挥更大的作用，从而推动临床上感染性疾病快速诊断的标准化。