Cell Painting在肿瘤药物筛选中的应用：技术原理、现阶段成果与前景
2025-10-11 来源:本站 点击次数:41
表型药物筛选（Phenotypic Drug Discovery, PDD）通过在细胞或组织水平上观察化合物对疾病表型的调控作用来发现新药，尤其适用于多基因疾病或靶点不明确的肿瘤类型。与传统靶向筛选相比，PDD 更易发现具有新机制的潜在药物[1]。高内涵筛选（High Content Screening, HCS）作为 PDD 的核心技术，通过自动化显微镜获取细胞图像，并利用 AI 加持的图像分析算法提取形态学特征，从而量化化合物效应，在疾病模型的药物筛选阶段，提供出色的筛选速度和筛选能力。
Cell Painting 是当前最常用的高内涵形态学分析方案之一，由 Gustafsdottir 等人于 2013 年提出[2]。该技术使用六种荧光染料标记八个细胞结构（细胞核、核仁、内质网、线粒体、高尔基体、细胞膜、RNA 和细胞骨架），通过多通道成像获取上千个形态特征，从而全面捕捉细胞状态的变化[3]。Cell Painting 的优势在于其无需预设靶点，能够发现未知机制化合物，并适用于多种细胞类型和扰动方式。近年来，随着图像分析算法、深度学习方法和计算平台的快速发展，Cell Painting 已在肿瘤机制研究、药物发现和毒性预测等领域展现出广泛的应用价值，并且推动了多种候选药物进入临床或临床前阶段[4]。
本文将系统回顾 Cell Painting 技术的原理与进展，重点阐述其在肿瘤研究中的应用现状，特别是在药物筛选和机制解析方面的作用，并对当前面临的挑战和未来发展方向进行讨论。
01
Cell Painting 技术原理与流程
Cell Painting 自提出以来历经十年发展，技术已经过多个版本的更新，优化了重复性与标准化流程，目前全球超 36 家学术机构及 51 家企业采用。
标准 Cell Painting 实验采用经过优化的染料组合方案：
Hoechst 33342 用于标记细胞核，Concanavalin A-Alexa Fluor 488 特异性染色内质网，SYTO 14 显示核仁与胞质 RNA 分布，Phalloidin（如 Alexa Fluor 568 或 750）标记 F- 肌动蛋白细胞骨架，Wheat Germ Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 555 揭示高尔基体与细胞膜结构，MitoTracker Deep Red 则用于跟踪线粒体。
成像过程通常使用高质量物镜，采集多通道 Z-stack 图像，后续通过图像处理软件对多层图像进行投影或深度投影算法进行分析处理，可获取包括形态、纹理、强度等在内的千余个特征，从而构建高维形态谱[3]。
由于 Cell Painting 技术涉及样本制备、染色、成像及数据分析等多个实验环节，各环节操作差异易影响结果稳定性，为提升实验数据的可比性与重现性，国际合作组织 JUMP-CP（Joint Undertaking for Morphological Profiling – Cell Painting）通过构建包含 90 种不同作用机制化合物的阳性对照体系，首次实现了 Cell Painting 实验条件的系统性定量优化。
该优化策略不仅有效提升了实验数据质量，还显著增强了不同检测平台间结果的一致性[5]。
早期的 Cell Painting 数据分析依赖于传统的图像处理软件（如 CellProfiler），通过分割细胞和亚细胞结构来提取形态特征。然而，这种方法在处理大规模数据时计算成本高、耗时长。近年来，基于人工智能的深度学习方法的引入极大地提升了图像分析的效率与准确性。例如，Molecular Devices 公司的 IN Carta 分析软件，能够直接从原始图像中提取特征，无需多步骤显式分割，不仅在速度上具有优势，还在多通量药物筛选任务中表现出比传统方法更高的图像分割以及分割后分类的准确率。
02
Cell Painting 在肿瘤药物筛选中的应用
虽然 2D 细胞模型具有操作简便、成本较低的优势，但其在模拟肿瘤微环境复杂性、细胞间相互作用机制和药物渗透性特性方面存在明显局限。3D 细胞模型通过模拟体内细胞外基质结构，构建三维生长微环境，可重现细胞间紧密连接、梯度营养分布及细胞与基质的相互作用，更贴近生理状态下的细胞功能。其药物渗透、代谢及毒性反应评估结果与体内实验相关性更高，能更精准预测药物在体疗效与安全性，为临床前药物筛选提供更可靠的科学依据，助力提升药物研发效率与成功率。尽管 Cell Painting 技术最初是针对 2D 细胞模型开发的，但近年来已有多项研究证实其在 3D 肿瘤模型中的成功应用[6]。
其中，由 Molecular Devices、Tulane University 和 Protein Fluidics 联合开展的一项研究，首次将 Cell Painting 技术应用于 3D 肿瘤模型的药物筛选。该研究从一名对传统化疗（阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇）耐药的三阴性乳腺癌患者体内建立了 TU-BcX-4IC 细胞系，该细胞系代表了一种化生性乳腺癌伴有三阴性乳腺癌（TNBC）表型 [7]。通过将 2D 扩增的细胞接种于 U 型底超低吸附 384 孔板中，成功形成了均匀的 3D 肿瘤球。利用 Molecular Devices 公司的 ImageXpress confocal 高内涵成像系统搭配自动化工作站，对 168 种 FDA 批准的抗癌药物进行了五浓度筛选（10 nM 至 100 μM）。以 24 小时为时间间隔进行明场和荧光成像，并利用 MetaXpress 和 IN Carta™ 分析软件评估肿瘤球的大小、完整性和细胞活性。
Fig 2. Schematic diagram of the experimental workflow including generation of patient-derived cell line, formation of tumoroids in 384 well U-shape low attachment plates, compound treatment, staining, imaging and analysis [7]
该研究通过 Cell Painting 的优化方案（包括延长染色时间、使用远红色 Phalloidin 分离肌动蛋白与高尔基体信号），成功获取了 3D 肿瘤球的六通道荧光图像，结合图像的深度学习分割和数据分析，研究人员从每个肿瘤球中提取了 210 个形态特征，并利用分析软件进行主成分分析（PCA）和聚类分析，计算出每种药物的表型距离分数，以此评估药物对肿瘤类器官的影响。结果显示，该筛选体系成功识别出多种机制类别的活性化合物，包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂（romidepsin、panobinostat）、蛋白酶体抑制剂（bortezomib、carfilzomib）和激酶抑制剂（trametinib、dasatinib）等。通过层次聚类分析，这些化合物根据其形态谱被分为不同的类别，与已知的作用机制（MoA）注释高度一致。该研究还比较了 2D 与 3D 模型在药物响应方面的差异。结果显示，对于某些化合物（如 carfilzomib、trametinib），3D 模型表现出更高的 EC50 值，提示其更好的耐药性模拟能力。
03
Cell Painting 在表型活性与毒性预测的应用
传统的细胞健康评估方法通常依赖于单一指标，如细胞活性或细胞死亡率，这些方法在反映细胞在复杂条件下的健康状态方面存在局限性。相比之下，Cell Painting 作为一种基于图像的形态学表型分析技术，通过多通道荧光成像多种细胞组分，能够提供细胞的多维度形态特征，从而更全面地反映细胞的健康状态。有研究利用 Cell Painting 技术对经不同化合物处理的细胞进行多通道荧光成像，该技术通过标记六种细胞器结构，生成了高达每细胞 1700 个维度的丰富形态学特征谱。
随后，他们进一步采集了与之匹配的、由特定荧光报告基因测定的细胞健康表型数据，并以此作为机器学习模型的训练标签。通过数学统计算法，成功构建了包括死细胞比例（R²=0.62）、S期细胞数量（R²=0.64）和凋亡细胞百分比（R²=0.37）等多种细胞健康表型[8]。Cell Painting 技术不仅能够识别有效化合物，还能在早期筛选阶段有效排除具有潜在毒性的候选分子，从而显著降低药物研发后期失败的风险。
04
Cell painting 技术的挑战与未来
尽管 Cell Painting 在肿瘤药物筛选中展现出巨大潜力，但其进一步发展仍面临若干挑战。Cell Painting 生成的高维数据虽然信息丰富，但如何将其转化为具有生物学意义的见解仍是一大难题。许多形态特征缺乏直观的生物学解释，且不同特征之间可能存在高度共线性。同时，生物学模型也进入高速发展阶段，目前比 2D 细胞更具有仿生性的 3D 细胞模型已逐渐走入更多的实验室，但是为了追求更加仿生且稳定的体外模型，科学家们正致力于构建更复杂、更加多元化的类器官及类器官共培养体系。但是 3D 环境中的光散射、荧光淬灭和细胞重叠等问题增加了图像采集与分析的难度。当前多数研究仍依赖于 2D 投影而非真正的 3D 重建，可能导致信息丢失或误解。开发更先进的 3D 图像采集技术、3D 信息重构技术和深度学习分割算法，将有助于提升 3D Cell Painting 的数据质量与分析精度。另外如前文所述，Cell Painting 涉及多个步骤，需要更多例如 JUMP-CP 等研究组织以及更多的实验室，建立标准化的操作流程和数据处理方法，施以更多努力以实现真正的数据互通与整合。
05
讨论
Cell Painting 作为一种高通量、多参数、无偏的细胞表型分析技术，已成为肿瘤药物筛选和机制研究的重要工具。
通过全面捕捉细胞在扰动下的形态变化，它不仅能够预测化合物的作用机制和毒性，还能揭示新的生物学见解和治疗靶点。
随着 3D 模型、深度学习技术和多模态数据整合方法的不断发展，Cell Painting 有望在个性化医疗和精准肿瘤学中发挥越来越重要的作用。
然而，要实现其全部潜力，仍需在数据解读、标准化和技术创新方面取得进一步突破。
相关产品链接：
ImageXpress HCS.ai 智能高内涵成像分析系统
参考文献
[1] Swinney DC, Anthony J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 2011 Jun.
[2] Gustafsdottir SM, Ljosa V, Sokolnicki KL, Anthony Wilson J, et.al. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 2013 Dec.
[3] Bray MA, Singh S, Han H, Davis CT, et.al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 2016 Sep.
[4] Seal S, Trapotsi MA, Spjuth O, et.al. Cell Painting: a decade of discovery and innovation in cellular imaging. Nat Methods. 2025 Feb.
[5] Cimini BA, Chandrasekaran SN, Kost-Alimova M, et.al. Optimizing the Cell Painting assay for image-based profiling. Nat Protoc. 2023 Jul.
[6] Imamura Y, Mukohara T, Shimono Y, et.al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 2015 Apr.
[7] Oksana Sirenko, Courtney K Brock, Angeline Lim, et.al. Evaluating Drug Response in 3D Triple Negative Breast Cancer Tumoroids with High Content Imaging and Analysis. Research Square. 2022 Aust.
[8] Way GP, Kost-Alimova M, Shibue T, et.al. Predicting cell health phenotypes using image-based morphology profiling. Mol Biol Cell. 2021 Apr.
Cell Painting 是当前最常用的高内涵形态学分析方案之一，由 Gustafsdottir 等人于 2013 年提出[2]。该技术使用六种荧光染料标记八个细胞结构（细胞核、核仁、内质网、线粒体、高尔基体、细胞膜、RNA 和细胞骨架），通过多通道成像获取上千个形态特征，从而全面捕捉细胞状态的变化[3]。Cell Painting 的优势在于其无需预设靶点，能够发现未知机制化合物，并适用于多种细胞类型和扰动方式。近年来，随着图像分析算法、深度学习方法和计算平台的快速发展，Cell Painting 已在肿瘤机制研究、药物发现和毒性预测等领域展现出广泛的应用价值，并且推动了多种候选药物进入临床或临床前阶段[4]。
本文将系统回顾 Cell Painting 技术的原理与进展，重点阐述其在肿瘤研究中的应用现状，特别是在药物筛选和机制解析方面的作用，并对当前面临的挑战和未来发展方向进行讨论。
01
Cell Painting 技术原理与流程
Cell Painting 自提出以来历经十年发展，技术已经过多个版本的更新，优化了重复性与标准化流程，目前全球超 36 家学术机构及 51 家企业采用。
标准 Cell Painting 实验采用经过优化的染料组合方案：
Hoechst 33342 用于标记细胞核，Concanavalin A-Alexa Fluor 488 特异性染色内质网，SYTO 14 显示核仁与胞质 RNA 分布，Phalloidin（如 Alexa Fluor 568 或 750）标记 F- 肌动蛋白细胞骨架，Wheat Germ Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 555 揭示高尔基体与细胞膜结构，MitoTracker Deep Red 则用于跟踪线粒体。
成像过程通常使用高质量物镜，采集多通道 Z-stack 图像，后续通过图像处理软件对多层图像进行投影或深度投影算法进行分析处理，可获取包括形态、纹理、强度等在内的千余个特征，从而构建高维形态谱[3]。
由于 Cell Painting 技术涉及样本制备、染色、成像及数据分析等多个实验环节，各环节操作差异易影响结果稳定性，为提升实验数据的可比性与重现性，国际合作组织 JUMP-CP（Joint Undertaking for Morphological Profiling – Cell Painting）通过构建包含 90 种不同作用机制化合物的阳性对照体系，首次实现了 Cell Painting 实验条件的系统性定量优化。
该优化策略不仅有效提升了实验数据质量，还显著增强了不同检测平台间结果的一致性[5]。
Fig 1. Morphological profiling using the Cell Painting assay [4]. A) Schematic representation of Cell Painting assay. B) Imaging and segmentation. C) Deep learning-based methods are applied to measure or calculate morphological features from the images. D) Downstream analysis. E) BODIPY to mark lipid droplets in lipid-accumulating cells. F) Coronavirus antibody against human coronavirus 229E (CoV-229E) viral protein
早期的 Cell Painting 数据分析依赖于传统的图像处理软件（如 CellProfiler），通过分割细胞和亚细胞结构来提取形态特征。然而，这种方法在处理大规模数据时计算成本高、耗时长。近年来，基于人工智能的深度学习方法的引入极大地提升了图像分析的效率与准确性。例如，Molecular Devices 公司的 IN Carta 分析软件，能够直接从原始图像中提取特征，无需多步骤显式分割，不仅在速度上具有优势，还在多通量药物筛选任务中表现出比传统方法更高的图像分割以及分割后分类的准确率。
Video 1. Six cell painting assays being acquired using MetaXpress Acquire (Molecular Devices) at 20x magnification on a 84 well plate
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Cell Painting 在肿瘤药物筛选中的应用
虽然 2D 细胞模型具有操作简便、成本较低的优势，但其在模拟肿瘤微环境复杂性、细胞间相互作用机制和药物渗透性特性方面存在明显局限。3D 细胞模型通过模拟体内细胞外基质结构，构建三维生长微环境，可重现细胞间紧密连接、梯度营养分布及细胞与基质的相互作用，更贴近生理状态下的细胞功能。其药物渗透、代谢及毒性反应评估结果与体内实验相关性更高，能更精准预测药物在体疗效与安全性，为临床前药物筛选提供更可靠的科学依据，助力提升药物研发效率与成功率。尽管 Cell Painting 技术最初是针对 2D 细胞模型开发的，但近年来已有多项研究证实其在 3D 肿瘤模型中的成功应用[6]。
其中，由 Molecular Devices、Tulane University 和 Protein Fluidics 联合开展的一项研究，首次将 Cell Painting 技术应用于 3D 肿瘤模型的药物筛选。该研究从一名对传统化疗（阿霉素、环磷酰胺、紫杉醇）耐药的三阴性乳腺癌患者体内建立了 TU-BcX-4IC 细胞系，该细胞系代表了一种化生性乳腺癌伴有三阴性乳腺癌（TNBC）表型 [7]。通过将 2D 扩增的细胞接种于 U 型底超低吸附 384 孔板中，成功形成了均匀的 3D 肿瘤球。利用 Molecular Devices 公司的 ImageXpress confocal 高内涵成像系统搭配自动化工作站，对 168 种 FDA 批准的抗癌药物进行了五浓度筛选（10 nM 至 100 μM）。以 24 小时为时间间隔进行明场和荧光成像，并利用 MetaXpress 和 IN Carta™ 分析软件评估肿瘤球的大小、完整性和细胞活性。
Fig 2. Schematic diagram of the experimental workflow including generation of patient-derived cell line, formation of tumoroids in 384 well U-shape low attachment plates, compound treatment, staining, imaging and analysis [7]
该研究通过 Cell Painting 的优化方案（包括延长染色时间、使用远红色 Phalloidin 分离肌动蛋白与高尔基体信号），成功获取了 3D 肿瘤球的六通道荧光图像，结合图像的深度学习分割和数据分析，研究人员从每个肿瘤球中提取了 210 个形态特征，并利用分析软件进行主成分分析（PCA）和聚类分析，计算出每种药物的表型距离分数，以此评估药物对肿瘤类器官的影响。结果显示，该筛选体系成功识别出多种机制类别的活性化合物，包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂（romidepsin、panobinostat）、蛋白酶体抑制剂（bortezomib、carfilzomib）和激酶抑制剂（trametinib、dasatinib）等。通过层次聚类分析，这些化合物根据其形态谱被分为不同的类别，与已知的作用机制（MoA）注释高度一致。该研究还比较了 2D 与 3D 模型在药物响应方面的差异。结果显示，对于某些化合物（如 carfilzomib、trametinib），3D 模型表现出更高的 EC50 值，提示其更好的耐药性模拟能力。
Fig 3.The Cell Painting assay modified for 3D spheroids. A) Spheroids were labeled with phalloidin,MitoTracker, WGA, SYTO 14, concanavalin A and Hoechst 33342. B) Scatterplot representing the phenotypic distance score for each compound is shown. C) Results of cluster analysis are represented as a hierarchical dendrogram. D) Example images grouped by cluster from the Cell Painting assay
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Cell Painting 在表型活性与毒性预测的应用
传统的细胞健康评估方法通常依赖于单一指标，如细胞活性或细胞死亡率，这些方法在反映细胞在复杂条件下的健康状态方面存在局限性。相比之下，Cell Painting 作为一种基于图像的形态学表型分析技术，通过多通道荧光成像多种细胞组分，能够提供细胞的多维度形态特征，从而更全面地反映细胞的健康状态。有研究利用 Cell Painting 技术对经不同化合物处理的细胞进行多通道荧光成像，该技术通过标记六种细胞器结构，生成了高达每细胞 1700 个维度的丰富形态学特征谱。
随后，他们进一步采集了与之匹配的、由特定荧光报告基因测定的细胞健康表型数据，并以此作为机器学习模型的训练标签。通过数学统计算法，成功构建了包括死细胞比例（R²=0.62）、S期细胞数量（R²=0.64）和凋亡细胞百分比（R²=0.37）等多种细胞健康表型[8]。Cell Painting 技术不仅能够识别有效化合物，还能在早期筛选阶段有效排除具有潜在毒性的候选分子，从而显著降低药物研发后期失败的风险。
04
Cell painting 技术的挑战与未来
尽管 Cell Painting 在肿瘤药物筛选中展现出巨大潜力，但其进一步发展仍面临若干挑战。Cell Painting 生成的高维数据虽然信息丰富，但如何将其转化为具有生物学意义的见解仍是一大难题。许多形态特征缺乏直观的生物学解释，且不同特征之间可能存在高度共线性。同时，生物学模型也进入高速发展阶段，目前比 2D 细胞更具有仿生性的 3D 细胞模型已逐渐走入更多的实验室，但是为了追求更加仿生且稳定的体外模型，科学家们正致力于构建更复杂、更加多元化的类器官及类器官共培养体系。但是 3D 环境中的光散射、荧光淬灭和细胞重叠等问题增加了图像采集与分析的难度。当前多数研究仍依赖于 2D 投影而非真正的 3D 重建，可能导致信息丢失或误解。开发更先进的 3D 图像采集技术、3D 信息重构技术和深度学习分割算法，将有助于提升 3D Cell Painting 的数据质量与分析精度。另外如前文所述，Cell Painting 涉及多个步骤，需要更多例如 JUMP-CP 等研究组织以及更多的实验室，建立标准化的操作流程和数据处理方法，施以更多努力以实现真正的数据互通与整合。
05
讨论
Cell Painting 作为一种高通量、多参数、无偏的细胞表型分析技术，已成为肿瘤药物筛选和机制研究的重要工具。
通过全面捕捉细胞在扰动下的形态变化，它不仅能够预测化合物的作用机制和毒性，还能揭示新的生物学见解和治疗靶点。
随着 3D 模型、深度学习技术和多模态数据整合方法的不断发展，Cell Painting 有望在个性化医疗和精准肿瘤学中发挥越来越重要的作用。
然而，要实现其全部潜力，仍需在数据解读、标准化和技术创新方面取得进一步突破。
相关产品链接：
ImageXpress HCS.ai 智能高内涵成像分析系统
参考文献
[1] Swinney DC, Anthony J. How were new medicines discovered? Nat Rev Drug Discov. 2011 Jun.
[2] Gustafsdottir SM, Ljosa V, Sokolnicki KL, Anthony Wilson J, et.al. Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states. PLoS One. 2013 Dec.
[3] Bray MA, Singh S, Han H, Davis CT, et.al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 2016 Sep.
[4] Seal S, Trapotsi MA, Spjuth O, et.al. Cell Painting: a decade of discovery and innovation in cellular imaging. Nat Methods. 2025 Feb.
[5] Cimini BA, Chandrasekaran SN, Kost-Alimova M, et.al. Optimizing the Cell Painting assay for image-based profiling. Nat Protoc. 2023 Jul.
[6] Imamura Y, Mukohara T, Shimono Y, et.al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 2015 Apr.
[7] Oksana Sirenko, Courtney K Brock, Angeline Lim, et.al. Evaluating Drug Response in 3D Triple Negative Breast Cancer Tumoroids with High Content Imaging and Analysis. Research Square. 2022 Aust.
[8] Way GP, Kost-Alimova M, Shibue T, et.al. Predicting cell health phenotypes using image-based morphology profiling. Mol Biol Cell. 2021 Apr.
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