在利用Cre-loxP系统进行细胞特异性基因操作的研究中，每一个研究者最怕的可能就是在非目标组织中发现Cre活性漏表达。一旦遇到这种情况，第一个反应往往是：我这批小鼠还能用吗？实验数据是不是都废了？

答案是：不要慌！漏表达并不等同于不可用。许多广泛使用、并被领域公认的Cre品系本身也存在不同程度的泄漏。关键在于正确理解泄漏的来源、评估其对实验的具体影响，并通过严谨的基因型鉴定来规避误读。本文将深入探讨神经类和血管类Cre漏表达的区别及应对策略。

01 神经类Cre鼠生殖泄漏
神经科学研究中常用的Cre品系，如Nestin-Cre，Emx1-Cre或Camk2a-Cre，通常被认为具有较高的神经元特异性^[1]。然而，大量研究证实，神经类Cre鼠和flox鼠交配，可能出现大量生殖泄漏的情况，当Cre在生殖细胞（精子或卵子） 中发生泄漏表达时，会导致flox区域在配子形成过程中就被删除，从而直接传递给后代。

你本以为后代基因型是“Cre阴性; flox阳性”的对照组小鼠，实际上其全身所有细胞可能都已经是“杂合或纯合敲除”型了，因为它们从受精卵开始就继承了已被删除的等位基因。但因为这些品系的核心驱动效率足够强，在目标细胞群中能实现高效、特异的基因重组。所以仍然被广泛认可和使用。

如何应对？
遇到生殖泄漏严重的Cre鼠，与flox鼠交配后，要尽早对子代鼠严格进行双品系基因型的鉴定和筛选。

双阳性鼠的鉴定，包括对Cre和flox基因型的鉴定，flox基因型需要同时确认flox是否敲入，以及KO条带的有无。如果子代出现Cre阴性，flox阴性，KO阳性的基因型，说明亲本Cre鼠已经出现严重的生殖泄漏，需要及时剔除这样的亲本和子代小鼠；同时也要剔除Cre阳性，flox阴性，有KO条带的子代鼠，避免生殖泄漏范围进一步扩大。这样通过对后代进行严格的基因型鉴定，以确保敲除是组织特异性的而非全身性的。

02 血管类Cre泄漏：基因型检测的陷阱
常用的血管内皮细胞Cre品系，如 Tie2-Cre 和Cdh5-Cre，都有一个特点^[2]：在通过鼠尾或脚趾进行基因型鉴定时，你很可能在几乎所有组织（包括血液细胞）的DNA样本中都能检测到Cre介导的重组信号，即flox+KO嵌合；Cre阳性的基因型。

为什么会这样？
这是因为这些基因的启动子在胚胎发育早期（如在造血干细胞中）就有短暂但广泛的活性。这些早期表达Cre的细胞及其后代（包括各种血细胞）会永久地携带重组的基因，因此从这些细胞中提取的DNA会永远呈现阳性信号。这通常不影响体内实验， 在成年小鼠的体内，这些Cre的表达通常会被限制在血管内皮细胞中，具有很高的特异性。

如何应对与验证？
基因型PCR检测的是“DNA是否被重组过”，而不是“Cre现在是否在表达”。阳性信号只代表动物体内存在一些发生过重组的细胞，并不代表你的目标组织（如心脏、大脑的血管）被特异性敲除了。

如果担心Cre有漏表达现象，可先通过基因型鉴定，筛选出flox+KO嵌合；Cre阳性的基因型。再通过免疫组化（IHC） 或免疫荧光（IF），在组织切片水平直接观察你的目标基因蛋白是否在血管内皮细胞中被成功敲除，同时在其他细胞类型（如周围的平滑肌细胞、神经元、血细胞）中是否仍然存在^[3]。这是证明其体内特异性的最直接证据。

血管类Cre鼠的泄漏信号是发育的痕迹，不代表成年期特异性丧失。只要通过组织学验证其在体内的内皮特异性，它们就完全可以正常使用。

如果遇到构建好的Cre鼠出现严重生殖泄漏，完全筛选不出特异性的后代，此时可优先选择用诱导型CreER鼠代替Cre鼠，该小鼠只有在给予他莫昔芬（Tamoxifen）后，CreER才会进入细胞核发挥作用，这可以极大地控制重组发生的时间，并有效避免发育早期或生殖系中的泄漏表达。

图1. Tamoxifen诱导的Cre-ER系统原理^[4]

总之，没有完美的Cre，几乎所有Cre品系都存在某种程度的泄漏，这是由启动子特性、插入位点、表观遗传等多种因素决定的。

遇到Cre漏表达，首先要做的是科学的诊断，而不是恐慌性的废弃。理解泄漏的性质，设计合理的鉴定和筛选方法，你的实验依然可以产出可信的数据。

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小鼠大学问 | Cre-Lox系统核心原理全解析
小鼠大学问 | Cre-lox系统的常见问题汇总

参考文献：
[1] Madison, L., et al. (2015). A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nature Neuroscience, 18(6), 793–802.

[2] Alva, J. A., et al. (2006). VE-Cadherin-Cre-recombinase transgenic mouse: a tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Developmental Dynamics, 235(3), 759–767.

[3] Tang, S., et al. (2010). A Cre recombination-based reporter system for mapping and manipulating neural circuits. Nature Protocols, 5(6), 1086–1100. 

[4] Kim H, Kim M, Im SK, Fang S.Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles oftarget genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147.

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