180微米深度高保真超分辨率成像重建图像线性相关性高达92%
2025-10-23 来源:本站 点击次数:44本研究成果由Qianxi Liang、Wei Ren、Boya Jin、Liang Qiao、Xichuan Ge、Yunzhe Fu、Xiaoqi Lv、Meiqi Li和Peng Xi共同完成，论文题为“High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal2 spinning-disk image scanning microscopy”，于2025年发表在《Light: Science & Applications》期刊。
重要发现
01光学系统设计与硬件实现
C2SD-ISM系统的核心在于其创新的光学配置，它巧妙融合了旋转盘共聚焦显微镜和数字微镜设备。旋转盘被放置在样本共轭平面上，通过物理方式实时移除离焦信号，从而减少背景干扰对后续重建过程的影响。数字微镜设备则用于生成稀疏多焦点照明模式，这种照明方式通过程序化控制实现高效采样。系统采用多模激光作为光源，并结合方形匀化光纤，确保照明均匀且无散斑。光学路径中，样本焦平面、旋转盘针孔阵列、数字微镜设备和sCMOS传感器平面均处于共轭状态，保证了成像的精确性。数字微镜设备的衍射特性经过系统优化，入射角设置为26.3°，可在多色成像（如561nm、488nm和405nm波长）中实现超过95%的衍射效率，出口角差异控制在可接受范围内，从而避免了视场偏差和照明不均问题。
旋转盘的设计采用阿基米德螺旋排列的针孔阵列，通过电子束光刻和蚀刻工艺制成。为了提升成像速度，研究团队开发了多同心螺旋设计（N>1），将全视场分为N个子区域进行并行扫描。理论表明，这种设计可将均匀照明速度提升N倍，例如当N=12时，曝光时间间隔缩短至原设计的1/12，从而简化了与旋转速度的同步操作。针孔直径与间距的比值设置为50μm:250μm，以平衡信噪比和分辨率。实验验证表明，旋转盘能有效增强成像对比度：在小鼠肾脏组织切片成像中，引入旋转盘后，局部对比度提升约三倍，且多焦点照明模式下的信噪比和点信号清晰度显著改善。这为后续算法重建提供了高质量输入数据。
03DPA-PR重建算法的高保真实现
传统图像扫描显微镜重建通常基于理想点扩散函数假设，但实际系统中存在斯托克斯位移和光学像差，导致重建保真度下降。C2SD-ISM系统引入了动态针孔阵列像素重分配算法，该算法通过构建虚拟探测器阵列来模拟多视角成像。具体过程包括：首先定位照明光学轴，然后对原始图像进行采样和重组，生成25张共聚焦子图像，最后通过相位互相关进行配准和叠加。重建结果进一步通过去卷积处理，实现近两倍的分辨率提升。与常规像素重分配方法相比，DPA-PR算法能自适应校正非理想因素，重建图像与衍射极限共聚焦图像的峰值信噪比和结构相似性指数更高，线性相关性R²达到0.92，显著降低了伪影。
04成像性能与生物应用验证
通过模拟实验和生物组织成像，C2SD-ISM系统展现了卓越的3D分辨率提升。在合成微管数据集中，引入旋转盘后，DPA-PR重建的横向分辨率提升至144纳米，轴向分辨率达351纳米，且结构细节更清晰。与计算背景去除算法（如滚动球和小波去噪）相比，旋转盘的物理离焦信号去除能更好地保留样本结构信息，实现更高的保真度。在实际生物样本如小鼠肾脏切片中，系统在12微米厚度样本上实现了高对比度成像，穿透深度达180微米。多色成像实验进一步验证了系统在tri-color标记样本（如线粒体、F-肌动蛋白和细胞核）中的稳定性，视场均匀性无波长差异。此外，系统的高通量能力通过斑马鱼血管3D成像得到体现，拼接成像覆盖2.91 mm x 1.26 mm x 0.18 mm体积，分辨率媲美高数值孔径物镜的共聚焦成像。
创新与亮点
C2SD-ISM系统的核心创新在于突破了深层组织超分辨率成像的多个技术难题。首先，通过双共聚焦策略物理性消除离焦信号，解决了传统计算方法导致的信号失真问题。旋转盘技术的引入不仅提升了成像对比度，还保留了原始强度分布，为高保真重建奠定了基础。其次，动态针孔阵列像素重分配算法克服了理想点扩散函数假设的局限性，能自适应校正斯托克斯位移和光学像差，实现近乎理论极限的分辨率提升。此外，数字微镜设备的程序化控制使系统支持多模态成像，如投影式结构化照明显微镜，进一步扩展了应用场景。系统价值体现在其高通用性上：它兼具高分辨率（横向144纳米、轴向351纳米）、大穿透深度（180微米）和高通量能力，适用于从细胞成像到组织尺度探索的多种生物研究需求。与现有技术相比，C2SD-ISM在保持高速成像的同时，显著降低了光毒性和伪影，为活体动态过程研究提供了新可能。
总结与展望
C2SD-ISM系统通过集成旋转盘共聚焦显微镜和数字微镜设备，结合创新算法，成功实现了高保真深层组织超分辨率成像。该系统在分辨率、穿透深度和重建保真度方面均表现出色，为生物医学研究提供了强大工具。未来，通过整合自适应光学技术，系统可进一步校正样本诱导像差，提升在复杂生物结构中的成像精度。长波长荧光探针和非线性激发策略（如双光子吸收）的引入，有望减少散射和自发荧光，扩展穿透深度。此外，深度学习算法的应用可优化重建过程，降低数据采集需求，实现实时超分辨率成像。C2SD-ISM平台的灵活性和可扩展性使其在动态生物过程观测和大规模生物研究中具有广阔前景，有望深化我们对复杂生物系统的理解。
声明：本文仅用作学术目的。
Liang Q, Ren W, Jin B, Qiao L, Ge X, Fu Y, Lv X, Li M, Xi P. High-fidelity tissue super-resolution imaging achieved with confocal2 spinning-disk image scanning microscopy. Light Sci Appl. 2025 Aug 4;14(1):260.
DOI:10.1038/s41377-025-01930-x.