期刊：Nature communications
影响因子：15.7
主要技术：华大C4 scRNA-seq，10x scRNA-seq

导语
代谢RNA标记结合高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够精确测量复杂生物过程中基因表达动态，如细胞状态转换和胚胎发育。该技术通过诱导碱基转换标记新合成的RNA以进行检测，依赖于转换效率、RNA完整性和转录本回收率。这些因素受所选化学转换方法和平台兼容性的影响。本研究使用Drop-seq平台对十种化学转换方法进行测试，分析了52,529个细胞。分析发现，基于beads的方法，特别是mCPBA/TFEA，优于原位（In-suit）方法。为评估体内应用，作者将这些优化方法应用于9,883个斑马鱼胚胎细胞在母体到合子转换期间，识别并验证了合子激活转录本，增强了合子基因检测能力。此外，作者还评估了两种捕获效率更高的商业化平台，发现固相上的碘乙酰胺（IAA）化学方法最为有效。本研究结果为选择最佳化学方法和scRNA-seq平台提供了关键指导，推动了复杂生物系统中RNA动态研究。

主要技术
华大C4 scRNA-seq，10x scRNA-seq

研究结果
1. 实验设计和计算质量控制评估
为全面测试代谢标记单细胞RNA测序（scRNA-seq）中不同化学转化方法的性能，作者以Drop-seq平台为基础，在源自斑马鱼胚胎的ZF4成纤维细胞系上测试了10种化学转化方法，通过dynast流程及专用质控流程，从RNA完整性、转化效率、RNA回收率三个维度评估方法优劣。结果显示，mCPBA/TFEA（pH5.2）等磁珠转化方法表现最优，平均T-to-C替换率超8%，且对cDNA完整性影响较小，每个细胞在10,000条测序reads下可检测约2,044个基因和5,468个UMI，与未处理样本水平相当，且磁珠方法中T-to-C替换率是原位转化方法的 2.32倍。这一结果为代谢标记scRNA-seq中化学转化方法的选择提供了直接基准，明确了磁珠上转化方法在效率和完整性上的优势，为后续研究奠定方法学基础。
 

图1 使用ZF4细胞对十种化学转化方法进行比较和评估。

2. 细胞周期中的 mRNA 控制策略
为探究代谢RNA标记在细胞周期mRNA调控研究中的应用价值，作者将52,529个经不同化学转化处理的细胞分为稳态和分裂细胞集群，结合流式细胞术、相关性分析及基因表达分析评估方法效果。结果表明，4sU标记本身不影响细胞周期分布，但OsO₄和IAA（37°C）处理会导致分裂细胞减少；磁珠上转化方法在标记与未标记RNA检测上一致性更高（Pearson’sr>0.9），且mCPBA类方法能高效识别细胞周期相关基因（如tubb4b），其标记转录本比例与T-to-C替换率正相关，同时细胞周期基因的RNA半衰期显著短于管家基因。这一发现证实了优化后的代谢标记方法可准确捕捉细胞周期中的RNA动态，为解析细胞周期相关的基因表达调控机制提供了可靠技术手段，也为后续研究RNA稳定性与细胞功能的关联提供了数据支持。

3. 鉴定斑马鱼胚胎发育中的合子激活转录本
为验证优化化学转化方法在体内的适用性，研究以斑马鱼母源-合子转换为模型，在5.5hpf胚胎细胞（合子转录本占比9.33%）中应用不同方法，通过新RNA与总RNA比例（NTR）划分母源、合子及母源-合子基因，并与公开数据集对比。结果显示，基于mCPBA的方法能识别更多合子基因，约78%新转录RNA基因为母源-合子基因（MZ），与斑马鱼bulkRNA-seq及爪蟾新生RNA-seq结果高度一致，且T-to-C替换率越高，高NTR阈值下合子基因识别差异越显著，全胚胎原位杂交及内含子探针验证进一步确认了合子转录本的准确性。这一成果证明优化方法可高效解析体内胚胎发育中的RNA动态，为深入研究母源-合子转换机制及合子基因组激活（ZGA）提供了关键技术支撑，也为其他物种早期胚胎发育的转录组研究提供了参考。

图2 利用改进的化学转化方法在斑马鱼胚胎发育中鉴定合子激活转录本

4.鉴定斑马鱼胚胎发育中的合子激活转录本
为解决Drop-seq平台（细胞捕获效率约5%）在稀有细胞样本研究中的局限性，研究对比了10×Genomics和华大C4两种高捕获效率（约50%）商业化平台，测试不同化学转化方法与平台的兼容性。结果显示，华大C4支持磁珠上转化，其结合IAA（32°C）方法的T-to-C替换率最高（8.44%），文库复杂度也更优；10×Genomics仅限原位转化，转化效率较低但文库复杂度较高；相同原位化学条件下，C4平台的T-to-C替换率（5.74%）高于其他平台，且商业化平台在基因和UMI检测数上均优于定制化Drop-seq。这一对比明确了不同平台的优势与适用场景，为稀有细胞（如早期胚胎细胞）研究提供了平台与方法的最优组合方案，有助于推动低细胞量样本的转录组动态研究。
 

图3 10×Genomics、Drop-seq和华大C4高通量单细胞平台的比较

参考文献：
[1]ZhangX,PengM,ZhuJ,ZhaiX,WeiC,JiaoH,WuZ,HuangS,LiuM,LiW,YangW,MiaoK,XuQ,ChenLandHuP2025BenchmarkingmetabolicRNAlabelingtechniquesforhigh-throughputsingle-cellRNAsequencingNatCommun165952.