PRISM（Profiling of RNA In-situ through Single-round iMaging）是一种新型的高复用空间RNA成像技术，它通过颜色强度条形码策略，在传统荧光显微镜下实现单轮成像即可检测多达64种RNA转录本。该方法利用滚动圈扩增（RCA）和竞争性杂交原理，将荧光信号的强度分级与多通道光谱结合，克服了传统显微镜仅能分辨有限通道的瓶颈。PRISM技术无需复杂的流体学设备，整个工作流程可在一天内完成，显著降低了空间转录组学的技术门槛。研究团队在多个组织样本中验证了PRISM的实用性，包括小鼠胚胎发育图谱、人类肝癌微环境分析以及小鼠脑组织的3D成像，揭示了细胞类型分布、亚细胞RNA定位及肿瘤异质性等关键生物学信息。该技术的高通量、高分辨率和易用性，为生物医学研究提供了强有力的工具。

本研究的核心贡献者包括Tianyi Chang、Shihui Zhao、Kunyue Deng、Zhizhao Liao、Mingchuan Tang、Yanxi Zhu、Wuji Han、Chenxi Yu、Wenyi Fan、Mengcheng Jiang、Guanbo Wang、Dongfang Liu、Jirun Peng、Yuhong Pang、Peng Fei、Jianbin Wang、Chunhong Zheng和Yanyi Huang。研究成果以论文“High-plex spatial RNA imaging in one round with conventional microscopes using color-intensity barcodes”的形式，于2025年10月在《Nature Biotechnology》上发表。

重要发现
01PRISM技术原理与工作流程
PRISM技术的核心在于通过颜色强度条形码对RNA转录本进行编码。每个靶基因的padlock探针包含多个片段，每个片段对应一个荧光通道（如Texas Red、Alexa Fluor 488、Cy5、Cy3），并通过混合标记与未标记成像探针的比例，实现荧光强度的分级量化。这种设计使得在有限的光谱通道内（如3-4个通道），通过强度组合可产生大量可区分的条形码。例如，将三个通道分为五级强度（0-4/5），并结合第四个通道的双级强度，理论编码容量可达64种基因。关键创新是半径向量过滤策略，确保条形码在颜色空间中的角度分散，避免因扩增产物大小不均导致的信号混淆。

工作流程从padlock探针与靶RNA结合开始，经过连接和滚动圈扩增，产生大量相同的条形码序列。随后，通过单轮混合成像探针染色，利用竞争性杂交使每个片段按预设比例显示荧光强度。成像后，信号点被提取并投影到颜色空间，通过高斯拟合或手动边界划分进行条形码解码。该方法在传统显微镜下即可实现，无需多轮反应，减少了样本变形和配准误差。实验验证显示，PRISM的解码准确率超过95%，且对组织自发荧光有良好鲁棒性。

在小鼠胚胎发育研究中，PRISM生成了E12.5至E14.5阶段的3D细胞图谱，涵盖了超过425万个细胞，分为12种主要类型。研究揭示了神经系统、呼吸系统、运动系统和消化系统等器官的发育动态，例如脊髓中Hoxb8、Robo2和Stmn2基因的共表达，以及肢体发育中Wnt5a+和Tbx5+细胞的空间相关性。细胞互作分析显示，肝细胞中94%存在近距离相互作用，表明胚胎期肝小叶结构的早期形成。

在人类肝癌样本中，PRISM使用31个基因 panel（包括HBV核心蛋白编码序列），分析了约120万个细胞，识别出32种细胞类型，如肿瘤细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和免疫细胞亚型。空间分析揭示了肿瘤微环境的异质性，例如CAFs形成物理屏障阻碍免疫细胞浸润，以及B细胞在3D空间中形成淋巴样网络。这些发现为肝癌免疫治疗提供了新见解。

创新与亮点
PRISM技术的核心创新在于突破了传统光学成像的多路复用限制。常规荧光显微镜受限于光谱重叠，通常只能分辨4-5个通道，而PRISM通过颜色强度分级，将编码容量提升至64重，无需超分辨率或专用设备。这种“单轮成像”策略避免了多轮标记-剥离反应带来的样本损伤和配准难题，显著提高了实验效率和可重复性。此外，PRISM采用半径向量过滤优化条形码区分度，并通过调整荧光探针比例适应不同光学系统，展现了高度的灵活性和鲁棒性。

在生物医学价值方面，PRISM降低了空间转录组学的技术门槛，使普通实验室也能开展高通量空间RNA分析。它成功应用于胚胎发育、肿瘤微环境和神经科学等多个领域，提供了细胞互作、亚细胞定位和3D结构的全新见解。例如，在肝癌研究中，PRISM揭示了CAFs的屏障作用和免疫细胞空间异质性，为精准医疗提供了潜在靶点。技术开源性进一步促进了广泛采用，有望推动分子病理学和细胞图谱构建的普及。

总结与展望
PRISM技术通过颜色强度条形码实现了高效、易用的空间RNA成像，为生物医学研究提供了强大工具。它克服了传统显微镜的通道限制，并在多种组织类型中验证了其可靠性和广泛应用潜力。未来，PRISM可通过结合光激活染料或膨胀显微镜进一步提升复用能力和分辨率。虽然目前灵敏度较低（约10%），但通过增加靶基因探针数量有望改善。随着技术优化和社区推广，PRISM有望成为空间生物学的基础技术，推动疾病机制研究和临床诊断创新。

DOI:10.1038/s41587-025-02883-7.