类器官是干细胞经体外三维培养形成的 “微型器官”，结构与功能贴近真实器官，能弥补传统细胞系和动物模型的局限，广泛用于疾病建模、药物筛选等领域。但是由于类器官本身不透明，且常规切片对结构会产生损害。最近组织透明化技术的发展，使类器官研究有了更大的进步。借助组织透明化技术，可无损呈现类器官三维结构与细胞分布，动态追踪其发育及功能响应，既提升研究精准度与效率，也为疾病机制解析、个性化医疗提供关键支持。

2025 年，来自美国得克萨斯大学西南医学中心、辛辛那提儿童医院医学中心等机构的研究团队，在《Nature Communications》发表了题名为 “Cellular crosstalk mediated by TGF-β drives epithelial-mesenchymal transition in patient-derived multi-compartment biliary organoids”的研究论文。该团队不仅成功构建了能精准模拟人类胆道结构与功能的多腔室胆道类器官（MBOs）模型，更借助这一模型，揭示了在新生儿胆道闭锁（BA，一种致死性儿科胆管疾病）中，由转化生长因子 -β（TGF-β）介导的细胞间通讯，是驱动胆管上皮 - 间质转化（EMT）、引发胆道结构缺陷与纤维化的关键致病通路。

研究的主要结果
1、模型构建：多腔室胆道类器官（MBOs）的构建与验证
将正常肝或 BA 患者肝来源的胆管上皮类器官细胞，与 HUVECs（人脐静脉内皮细胞）、MSCs（间充质干细胞）按特定比例（胆管上皮细胞 4.7×10⁵个、HUVECs 3.3×10⁵个、MSCs 1.0×10⁵个）混合，接种于基底膜提取物（BME）与内皮细胞培养基（EGM）的混合基质中，先经扩张培养基（EM）培养 5 天，再用胆管分化培养基（DM）培养 9 天，最终形成 3D 结构的 MBOs（图1）。

图 1 MBO(多腔室胆道类器官)的构建与检测

a：MBO 构建步骤示意图（含细胞混合、扩张培养、分化培养阶段）；
b-c：培养 5 天、10 天、14 天后 MBOs 外层细胞层面积量化结果（5-10 天外层细胞层面积增长 4 倍）及相位差显微镜下结构变化；
d-e： 整体免疫染色显示 MBOs 中 CK19⁺上皮细胞（红色）、CD31⁺内皮细胞（绿色）、VIM⁺间充质细胞（白色）的分布，与 3 日龄小鼠肝外胆管解剖结构高度一致；
g-h：PEGASOS 透明化处理后，免疫染色显示 MBO 与 3-4 日龄小鼠肝外胆管中 EPCAM（白色）和 TROP2（红色）的表达（MBO 中 PBGs 呈 TROP2 低表达 / EPCAM⁺）；
i：FACS 分析结果（MBO 中 TROP2 低表达 / EPCAM⁺的 PBG 细胞数量是单一上皮类器官（Mono）的 30 倍）；
j：免疫染色显示 MBOs 中 SOX9（红色）、SOX2（红色）、CK19（绿色）和细胞核（蓝色；DAPI）的信号分布（PBG 样结构表达 SOX9、SOX2 等祖细胞标志物）。

通过透明化后的 3D 成像，清晰观察到 NC-MBOs（正常 MBOs）的分层结构：外层 CK19⁺上皮细胞形成连续的胆管样结构，中央 CD31⁺内皮细胞和 VIM⁺间充质细胞形成支持网络，PBGs（胆管周围腺体）嵌入其中。对照实验显示，仅胆管上皮细胞与 MSCs 共培养无法形成完整 MBO 结构，仅与 HUVECs 共培养则无法形成类器官，证实内皮细胞和间充质细胞对 MBO 构建及 PBG 发育的必要性。

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2、机制发现：BA-MBOs 中 EMT 与 TGF-β 信号的异常激活
为解析 BA 的核心致病机制，研究通过单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）对 BA-MBOs（BA 患者来源 MBOs）与 NC-MBOs 进行对比分析，结果如下：
1.异常中间细胞群富集：BA-MBOs 中存在 3 个异常富集的 “中间细胞群”（Intermediate 1/2/4），分别高表达 TGF-β 诱导 EMT 的介导基因（如 LGALS1、IGFBP7）、ECM 重塑基因（如 LOX、FN1），且是 TGF-β 的主要分泌来源；

2.TGF-β3 信号过度激活：BA-MBOs 中间充质细胞分泌的 TGF-β3 量是 NC-MBOs 的 4 倍，可通过激活上皮细胞的 SMAD2/3 通路，上调 SNAI1、ZEB2 等 EMT 转录因子；

3.上皮细胞表型异常：EMT 激活导致 BA-MBOs 中上皮细胞失去极性，形成 “pan-CK⁺/VIM⁺混合细胞”，上皮极性标志物 ZO1、E - 钙黏蛋白表达分布异常，酸性黏蛋白分泌能力显著下降（Alcian Blue 染色阳性率仅为 NC-MBOs 的 1/5）。

图 2 对类器官细胞的谱系分析

a-b：BA-MBO 与 NC-MBO 的相位差显微镜图像及 CK19⁺上皮细胞数量量化（BA-MBOs 中 CK19⁺细胞数量减少 40%）；
c：免疫染色对比两种类器官的 TGF-β3 表达（BA-MBOs 中 TGF-β3 染色强度是 NC-MBOs 的 4 倍）；
d：第 5 天和第 14 天 MBO 的 FACS 结果（第 14 天 BA-MBOs 中 pan-CK⁺/VIM⁺混合细胞数量是 NC-MBOs 的 2 倍，pan-CK⁺/VIM⁻上皮细胞数量减少 3 倍）；
e：scRNA-seq 的 UMAP 图（按细胞类型着色，含上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞及 5 个中间细胞群）；
f：中间细胞群的 MSigDB 通路富集结果（EMT、TGF-β 受体信号通路显著富集）；
g：各细胞群在 MBO 中的比例（BA-MBOs 中 Intermediate 2/4 细胞群占比增加 2-3 倍）；
h：UMAP 图中叠加的 EMT 评分（BA-MBOs 中中间细胞群 EMT 评分显著高于 NC-MBOs）。
长期培养实验显示，将 MBOs 培养至 28 天时，NC-MBOs 仍维持完整上皮结构，而 BA-MBOs 中 VIM⁺细胞进一步扩张，上皮细胞体积减少约 3 倍，再现了 BA 患者胆道纤维化的进展特征。

3、治疗探索：TGF-β 抑制剂对 BA 表型的逆转作用既往恐惧经历促进后续厌恶学习
体内外实验验证 TGF-β 抑制剂 A8301 对 BA 表型的逆转效果，具体结果如下：
1.体外实验（BA-MBOs）：
（1）10μM A8301 处理后，BA-MBOs 中 pan-CK⁺/VIM⁺混合细胞数量减少 60%，pan-CK⁺/VIM⁻上皮细胞数量增加 2 倍；
（2）透明化 3D 成像显示（图3C），上皮层连续性恢复，CK19⁺细胞形成的表面积与 NC-MBOs 无显著差异（p>0.05），PBGs 数量和大小分别增加 2.5 倍、3 倍；
（3）上皮功能恢复：ZO1、E - 钙黏蛋白重新定位于细胞顶端，酸性黏蛋白分泌能力恢复至 NC-MBOs 的 80%。

2.体内实验（BA 模型小鼠）：
对 RRV（恒河猴轮状病毒）感染诱导的 BA 模型小鼠，腹腔注射 A8301（1mg/kg 体重 / 天），结果显示：
（1）黄疸发生率从 80% 降至 25%，21 天存活率从 30% 提升至 75%；
（2）血清胆红素、谷丙转氨酶（ALT）水平分别降低 60%、55%；
（3）肝组织病理显示，肝外胆管上皮完整性恢复，门静脉区纤维化程度显著减轻（Sirius Red 染色阳性面积减少 50%）。

图 3 抑制TGF-β的表达对BA 表型存在恢复作用

a：A8301 体外抑制 BA-MBOs 中 TGF-β 信号的流程示意图（含药物处理时间、浓度）；
b：FACS 定量第 14 天 A8301 处理后 MBOs 的胆管及间充质细胞数量；
c：A8301 处理后 ，PEGASOS透明化MBOs 的免疫染色图像（CK19：红，CD31：绿，VIM：白）及 CK19⁺结构数量、PBG 样结构大小定量；
d-f：A8301 处理后 BA-MBOs 的 E - 钙黏蛋白表达、ZO1 表达及 Alcian Blue 染色结果（黏液分泌能力显著恢复）；
g-h：BA 患者与正常对照血清中 TGF-β1/2/3 及 INHBA 的表达水平（BA 患者血清 TGF-β3 含量是正常对照的 3 倍）。

研究总结
该研究通过构建多腔室胆道类器官（MBOs）模型，首次在体外模拟了人类胆道的双重上皮结构（胆管上皮 + 胆管周围腺体），并明确了 TGF-β 介导的细胞间通讯在 BA 发病中的核心作用：
1.模型创新：MBOs 模型解决了传统单一上皮类器官无法模拟胆道微环境的局限，可用于 BA 发病机制研究及药物筛选；
2.机制突破：证实 TGF-β3-SMAD2/3-EMT 通路是 BA 胆道结构缺陷与纤维化的关键驱动通路；
3.治疗潜力：体内外实验证实 TGF-β 抑制剂 A8301 可有效逆转 BA 表型，为 BA 的靶向治疗提供了新方向。

该研究不仅为胆道疾病研究提供了更贴近生理状态的实验工具，也为 BA 的临床转化研究奠定了理论基础，未来有望通过 TGF-β 抑制剂联合其他疗法，改善 BA 患者的预后。

参考文献
Ayabe H, DePasquale EAK, Amarachintha SP, et al. Cellular crosstalk mediated by TGF-β drives epithelial-mesenchymal transition in patient-derived multi-compartment biliary organoids. Nat Commun. 2025 Jul 17;16(1):6575. doi: 10.1038/s41467-025-61442-5. 

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