本文要点：本研究设计合成了一种可被一氧化氮高效激活的D-π-A-π-D型有机小分子CTBA。该分子在可见光区具有吸收和发射特性，当与肿瘤微环境中过量一氧化氮反应后，可转化为新型结构分子CTBT，在808 nm激发下展现出卓越的NIR-II荧光、光动力及光热性能。值得注意的是，这种可激活探针首次实现三大关键特性的融合：（1）用于深组织可视化的NIR-II成像能力；（2）按需激活响应功能进行治疗；（3）光动力-光热协同效应，这是此类集成系统的首次报道。凭借其"开关式"特性，该探针显著降低了成像背景噪声及光疗过程对正常组织的损伤。通过CTBA与PS1000-PEG2000自组装构建的CTBA-NPs，在体外和体内实验中均实现了高度精准高效的肿瘤诊疗，为设计激活型多功能NIR-II荧光探针提供了创新策略。
 

方案1.（a）CTBA NPs制备方案（b）可激活NIR-II荧光CTBA NPs成像引导PDT/PTT协同治疗的机制

为获得具有NO响应的NIR-II发射的荧光团，研究者将苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺作为电子受体与电子供体环戊烯并[2,1-b:3,4-b']二噻吩（CPDT）及噻吩单元结合，构建出D-π-A-π-D型有机荧光分子CTBA。作为电子供体，CPDT在结合合适电子受体时，可使探针在激光激发下实现光动力或光热效应，其高电子密度特性还能确保荧光团在近红外II区发射。同时引入的富电子噻吩单元作为π桥，增强了电子离域化。CTBA的合成路线如图1a所示。当受体与一氧化氮反应后，CTBA可转化为新型结构CTBT，进而引发光物理性质变化（图1b）。首先通过光谱表征发现：CTBA在300-550 nm范围内吸收（峰值385 nm），发射光谱覆盖450-750 nm（最大发射560 nm）。当苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺被一氧化氮氧化形成更强受体5H-[1,2,3]三唑并[4,5-f]-2,1,3-苯并噻二唑时，分子内电荷转移（ICT）过程增强，导致能隙减小并实现显著红移。因此向CTBA溶液加入NO后，吸收光谱红移至600-900 nm，发射光谱则转移至NIR-II窗口（800-1200 nm），并伴随强NIR-II荧光（图1d）。MALDI-TOF-MS证实了CTBA与NO反应后三唑衍生物CTBT的形成（图1e），在1143处观察到特征质谱峰。

图1. CTBA的设计、合成及对NO的响应特性

为探究探针与一氧化氮反应前后光谱性质变化的机理，采用密度泛函理论（DFT）计算分析了CTBA与CTBT的几何构型及电子特性。如图1f所示，最高占据分子轨道（HOMO）主要分布于整个共轭骨架，而最低未占分子轨道（LUMO）则集中于受体部分，表明两者均存在明显的供体-受体相互作用和分子内电荷转移。值得注意的是，由于CTBT受体具有更强的吸电子能力，其LUMO电子较CTBA更集中于受体区域，导致LUMO能级从-2.11 eV降至-3.11 eV。同时伴随HOMO能级部分升高，最终使CTBT的HOMO-LUMO能隙减小至1.32 eV。更窄的能隙更易实现长波长吸收，这与实验观测到的显著光谱红移现象一致。这些光谱性质变化表明，CTBA可作为理想的NIR-II荧光探针用于一氧化氮检测。

图2. CTBA-NPs的制备、光物理特性及对一氧化氮的响应

为提高生物医学应用的生物相容性，采用纳米共沉淀法通过PS1000-PEG2000包封 CTBA构建CTBA-NPs。随后对其光物理性质进行检测。如图2a所示，CTBA-NPs的光谱与CTBA相似，吸收范围300-550 nm，发射范围500-750 nm。图2b显示CTBA-NPs的水合粒径约为96 nm。扫描电镜（SEM）图像表明其形貌呈均匀球形。在水中储存30天后，CTBA-NPs的粒径、吸收及荧光光谱均未发生显著变化，证实其具有优异的胶体稳定性（图2c-e）。此外，CTBA-NPs在生物条件下的稳定性也得到评估。7天内其光谱特性及粒径均未发生显著变化，进一步证实其出色的系统稳定性。

图3. CTBA-NPs的光动力和光热性能

如Jablonski分子能级图（图3a）所示，除辐射跃迁途径产生的荧光外，非辐射跃迁与系间窜越（ISC）途径也可能产生有效的光热或光动力效应。因此，本文评估了CTBA-NPs与一氧化氮作用前后的光治疗能力。首先，为检测近红外光激发产生的活性氧（ROS），采用2′,7′-二氯二氢荧光素（DCFH-DA）作为指示剂。在ROS存在时，DCFH-DA会被氧化为高荧光强度的2,7-二氯荧光素（DCF）。如图3b、c所示，未与一氧化氮反应的CTBA-NPs在808 nm激光照射下几乎不产生ROS（因其在808 nm处吸收可忽略），但当其与NO完全反应生成产物CTBT后，2.5 μM浓度下即可观察到大量ROS生成；浓度达10 μM时，ROS产量可达空白组的70倍。这表明CTBA-NPs经一氧化氮激活后具有显著的光动力效应。

此外，对CTBA-NPs的光热能力进行评估（图3d-f）。未激活状态下，808 nm激光照射未引发明显热效应；但经NO激活后，10 μM、25 μM和50 μM CTBA-NPs溶液温度在10分钟内分别升高12.2°C、17.4°C和22.1°C。通过图3g的温度变化曲线及图3h拟合公式计算，其光热转换效率η达22.3%。光热稳定性测试显示（图3i），经过五次激光开关循环，溶液温度升降趋势未出现明显波动，证实NO激活的CTBA-NPs具备良好的光热稳定性。综上，体外实验表明CTBA-NPs在NO激活前几乎无光治疗效应，而激活后在808 nm激光照射下表现出优异的光动力与光热协同治疗效果。这种"开关式"策略使其在肿瘤治疗应用中更具可控性。

图4. CTBA纳米粒的体外生物相容性及抗肿瘤作用

首先通过MTT法评估了CTBA-NPs的体外生物相容性。如图4a所示，当CTBA-NPs浓度在0-100μM范围内时，细胞存活率均保持在80%以上，表明CTBA-NPs具有优异的体外生物相容性，可进一步用于体内应用。随后评估了CTBA-NPs在HepG2细胞中的摄取性能。图4b、c显示，通过共聚焦显微镜（CLSM）可清晰观察到时间依赖性的细胞摄取现象：CTBA-NPs在8小时即可被HepG2细胞明显摄取，12小时完成内化，说明其能高效进入细胞，从而进一步探索光疗研究。鉴于CTBA-NPs可被一氧化氮有效激活，本文在不同条件下对癌细胞的毒性进行测试。图4d、e表明：当CTBA-NPs未被NO激活时，即使808 nm激光照射下HepG2与H22细胞，存活率仍高于80%；同样，NO激活但无激光照射时，对细胞的毒性也较低。这证实CTBA-NPs在缺乏NO和激光的条件下不会损伤细胞，确保其对正常组织的生物安全性。反之，当CTBA-NPs浓度达50 μM且被NO激活后，808 nm激光照射下两种癌细胞存活率分别降至~23%与~21%，激活态的CTBA-NPs在激光作用下产生显著的光动力与光热效应，导致肿瘤细胞损伤凋亡。

为验证该结果，研究者进行了钙黄绿素AM/碘化丙啶（calcein AM/PI）双染荧光成像实验。图4f显示，仅当CTBA-NPs被NO激活并接受激光照射时才能有效杀伤肿瘤细胞，与MTT结果一致。进一步通过DCFH-DA检测HepG2细胞内ROS水平发现（图4g），NO激活联合激光照射组产生明显绿色荧光，证实激活态CTBA-NPs可通过光动力作用杀伤肿瘤细胞。因此，该可激活光疗系统对正常细胞具有优异生物相容性，同时展现出强大的肿瘤细胞杀伤能力。

图5. CTBA-NPs 的 NIR-II 窗口中的体内肿瘤成像

由于深层组织穿透能力对近红外二区（NIR-II）成像至关重要，在开展活体成像前，首先评估了CTBA-NPs的组织穿透性能。如图5a所示，当CTBA-NPs与一氧化氮完全反应后，可产生明亮的NIR-II荧光。在未覆盖鸡胸肉组织的条件下，调节浓度后的CTBA-NPs与吲哚菁绿（ICG）在相同成像条件下亮度相当。但随着组织厚度逐渐增加，ICG信号强度显著下降，同时信背比（SBR）降低、半峰宽（FWHM）增大，成像分辨率明显劣化（图5b、c）。相比之下，当组织厚度小于4 mm时，CTBA-NPs的荧光信号仍能保持SBR＞2；即使厚度增至6 mm，仍可观测到其特征荧光信号。总体而言，CTBA-NPs在NIR-II成像中的SBR与FWHM指标均优于ICG，证实其适用于理想的活体NIR-II成像。

随后将CTBA-NPs应用于小鼠肿瘤NIR-II成像。通过增强渗透滞留（EPR）效应，CTBA-NPs可富集于肿瘤部位，并被肿瘤微环境中过量的一氧化氮激活。激活产物在808 nm激光照射下呈现显著NIR-II荧光。如图5d、e所示，12小时即可在肿瘤部位观察到明显荧光发射，随着CTBA-NPs持续富集及一氧化氮激活作用增强，72小时内荧光强度逐渐提升。值得注意的是，CTBA-NPs的NIR-II荧光具有一氧化氮特异性激活特性，成像过程中背景信号几乎不可见，表明该纳米荧光探针能实现灵敏、精准的肿瘤NIR-II成像。进一步通过瘤内注射脂多糖（LPS）溶液刺激炎症产生更多一氧化氮后，荧光强度显著增强，再次验证其激活机制。

最后对处死小鼠进行离体NIR-II成像。如图5f-i所示，得益于激活成像的特异性，小鼠主要器官均未观察到明显NIR-II荧光信号。LPS刺激后，其胃部和肠道出现微弱荧光，可能源自肿瘤部位激活的CTBA-NPs经消化系统代谢所致。但由于该信号强度远低于肿瘤组织，不会影响活体成像的准确性。这些结果表明，CTBA-NPs凭借一氧化氮特异性激活能力，可成为兼具肿瘤诊断与治疗潜力的优异NIR-II成像剂。

图6. CTBA纳米粒的体内抗肿瘤作用

为验证CTBA-NPs的光治疗潜力，随后在H22荷瘤小鼠模型中评估了其体内抗肿瘤效果。如图6a所示，将H22细胞皮下接种于BALB/C小鼠体内，待肿瘤体积生长至200±50 mm³时，将荷瘤小鼠随机分为六组（每组4只）：(1)PBS处理组；(2)PBS联合激光组；(3)CTBA-NPs处理组；(4)CTBA-NPs联合激光组（图6b）。如图6c、d所示，CTBA-NPs被肿瘤微环境中过量的一氧化氮激活后，在808 nm激光照射下表现出显著的光热效应，肿瘤部位温度可升高超过20°C，这与体外光热实验结果一致。从接种肿瘤起每2天测量各组小鼠体重与肿瘤体积。图6e显示各组小鼠体重无显著差异，而图6f-h表明G1、G2、G3组的肿瘤快速生长且无抑制效果，说明单独使用激光或CTBA-NPs均无法杀伤肿瘤细胞。值得注意的是，当CTBA-NPs与808 nm激光协同治疗时，肿瘤体积显著缩小甚至完全消失。该现象归因于被一氧化氮激活的CTBA-NPs在激光作用下产生具有细胞毒性的ROS，并发挥显著光热效应。此外，通过不同组别治疗后肿瘤组织的H&E染色进一步评估了CTBA-NPs的抗肿瘤能力。图6i显示治疗组肿瘤组织在光激发下呈现明显的细胞核损伤，表明细胞发生凋亡与坏死。综上，该可激活光疗系统展现出显著的肿瘤消融能力与卓越的生物安全性。

总之，本文设计并合成了一种可被一氧化氮激活的D-π-A-π-D型近红外二区诊疗一体化荧光探针，采用高电子密度给电子体CPDT与一氧化氮响应基团苯并[c][1,2,5]噻二唑-5,6-二胺受体结合，获得小分子荧光团CTBA，再通过PS1000–PEG2000包裹形成CTBA-NPs纳米颗粒。当CTBA-NPs在肿瘤微环境中被过量一氧化氮激活时，受体部分的邻苯二胺基团会转化为电子密度更低的三唑结构，使探针发射波长显著红移至近红外二区窗口；同时在808 nm激光照射下表现出显著的光动力与光热性能。该探针成功实现了小鼠肿瘤的精准近红外二区成像及光动力/光热协同治疗，为可激活近红外二区探针的设计开辟了新途径，并为肿瘤精准诊断与影像引导协同光疗提供了新策略。

参考文献

Zhang X, Li L, Ren Y, et al. Nitric oxide-activatable NIR-II organic small molecule for fluorescence imaging-guided synergistic photodynamic and photothermal therapy[J]. Chemical Science, 2025.

⭐️ ⭐️ ⭐️

动物活体荧光成像系统 - MARS 

In Vivo Imaging System

⭐️ ⭐️ ⭐️

 恒光智影

上海恒光智影医疗科技有限公司，被评为“国家高新技术企业”、“上海市专精特新中小企业”，获国家科技部“重大科学仪器研发专项”支持，荣获上海市“科技创新行动计划”科学仪器项目、上海市2025年度关键技术研发计划“计算生物学”项目。

恒光智影，致力于为生物医学、临床前和临床应用等相关领域的研究提供先进的、一体化的成像解决方案。

专注动物活体成像技术，成像范围覆盖 400-1700 nm，同时可整合CT, X-ray，超声，光声，光热成像等技术。

可为肿瘤药理、神经药理、心血管药理、大分子药代动力学等一系列学科的科研人员提供清晰的成像效果，为用户提供前沿的生物医药与科学仪器服务