Nature文章分享：在体CRISPR screening技术助力发现增强CAR-T靶点
2025-11-14 来源:生物快评 点击次数:66文章来源公众号：生物快评 作者：bio2you
2025年9月24日, Nature发文《In vivo CRISPR screens identify modifiers of CAR T cell function in myeloma》，这篇文章是哈佛医学院的Marcela V. Maus教授，她也是麻省总医院细胞免疫治疗项目的主任。
这里指的是CRISPR KO screening技术，简单介绍一下：就是对一群T细胞转导gRNA文库，然后这群细胞中，某一些细胞亚群含有某一种基因敲除的表型。那么在给定一个筛选条件，让能够适应这种条件的、基因缺失的细胞群体，优胜劣汰出来。富集的T细胞在通过高通量测序分析是什么gRNA富集了，反推一下就知道是什么基因缺失了。
快速的结论
体外实验中，敲除RASA2 和 SOCS1 可增强 T 细胞的扩增；而在体内实验中，缺失PTPN2、ZC3H12A 和 RC3H1则赋予 CAR T 细胞早期的选择性生长优势。
值得注意的是，作者发现细胞周期调控因子——细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子 1B（CDKN1B） 是限制 CAR T 细胞在体内后期活性的重要因素。
敲除 CDKN1B可增强 BCMA CAR T 细胞对抗原的增殖和效应功能，从而显著提高肿瘤清除率和整体生存率。
目前在Google Scholar检索，去掉引用，共有57万“crispr screening”信息。
文章的细节1）是什么CRISPR筛选系统？
所用的是Mario’ library（有不同类型的gRNA文库），该文库靶向的是135个基因敲除，这些基因在一定程度上可能有T细胞的功能相关，每个基因有8个gRNA。对照无意gRNA有100个（靶向基因间区）。
这个筛选体系靶向的基因有限，所以敲除的靶点肯定在这个范围内，这限制了更大范围的筛选。
这个筛选所用的载体
载体1：靶向BCMA的CAR（4-1BBZ结构），这个CAR后面利用2A连接CD34t(短截体的CD34)，该载体是表达CAR所用，CD34t是便于检测CAR表达。
载体2：gRNA载体，该载体通过U6驱动gRNA转录，注意这里含有TRAC gRNA和靶向基因gRNA，TRAC gRNA是有两个目的：其一是为了避免后续体内筛选的BCMA-CAR-T对宿主造成GvHD，其二是为了检测和分选CD3阳性的T细胞，因为CD3阳性的T细胞即是未发生基因编辑的细胞。串联PGK1启动子驱动iCasp9表达，且iCasp9通过2A连接了一个筛选标记LNGFR，icasp9是一个诱导性的安全开关，这些和筛选无关，可以不要。
2）这个筛选怎么操作的？
首先活化T细胞，然后制备含有BCMA-CAR的慢病毒和含有gRNA的文库的慢病毒。
将上述慢病毒混合感染活化的T细胞，然后通过磁珠筛选去掉CD3阳性的T细胞，即得到了CD3阴性的经过文库编辑后的T细胞。
然后这些细胞通过尾静脉注射到含有MM.1S小鼠体内，在第21天在小鼠的骨髓中分离BCMA-CAR-T，最后通过测序关键敲除哪个基因的gRNA被富集了。
3）筛选得到什么基因敲除对于CAR-T比较好
红色是富集的gRNA的基因，即敲除带来优势的基因。
蓝色为丢失的gRNA的基因，暗示敲除带来不利影响。
因为这个是一个富集筛选，所以我们通常更加相信富集的敲除的基因更可靠。
题外话：基因敲除筛选真的就是一个“一网打尽”的系统吗？
目前很多课题组做全基因组基因敲除筛选、过表达筛选，然后按照自己的观察指标，进行基因富集。对得到靶点后再进行验证，通常在加上单细胞测序的数据。
似乎“Screening”+“single-cell Seq”是发高分文章的套路。
实际上，某个领域的一些关键基因很多都在早期都被发现了。目前想通过大规模的筛选，很难得到你想要的“新”的靶点，大概率是对旧的机制、通路的缝缝补补。
测序和筛选的钱，大概率只是得到了一个文章的“头”和“引子”。
其次你筛选得到的清单，非常困难得到一个不影响“其他功能”，只有好处的靶点。
最后很多人的筛选标准是“细胞增殖、细胞存活”，很多时候筛选得到了一些抗凋亡、促增长、或者是促癌基因，你所观察到的指标只是“细胞长快了为富集”，而不是因为你的筛选压力而富集。
怎么从别人的筛选中获得自己关心的靶点呢
首先，一般文章会提供筛选的清单，头部的靶点可能已经被作者重复，那么次要的靶点可以下载下来再看看。如果没有现成的清单excel，直接下载测序数据，自己用软件跑一下。
最后我们可以通过专利检索一下，如果一年左右，作者没有对发现靶点进行保护，大概率这些东西没有什么实际作用。