新型组织透明化技术助力保存小鼠组织结构
2025-11-27 来源:本站 点击次数:77骨髓作为生物体内负责造血的核心场所，其内部复杂的细胞与血管网络在生理稳态、免疫应答以及组织修复过程中扮演着关键角色。然而，由于骨髓组织深藏于坚硬的骨皮质内部，且其结构极为脆弱，传统成像技术难以在不破坏样本结构的前提下，实现对完整长骨（如小鼠股骨）骨髓腔深处进行高分辨率三维观测。这一技术瓶颈限制了对骨髓微环境，特别是细胞间相互作用和空间分布关系的深入理解。为此，研究团队开发了一种名为MarShie（骨髓屏蔽）的新型组织透明化技术。该技术通过引入SHIELD环氧化物固定、EDTA温和脱钙、主动脱脂以及Quadrol基团的漂白步骤，成功实现了对完整小鼠股骨骨髓结构的完美保存与高度透明化，为在单细胞乃至亚细胞水平上对骨髓进行三维定量分析铺平了道路。
本研究的重要发现由Till Fabian Mertens, Alina Tabea Liebheit, Johanna Ehl, Ralf Kohler, Asylkhan Rakhymzhan, Andrew Woehler, Lukas Katthan, Gernot Ebel, Wjatscheslaw Liublin, Ana Kasapi, Antigoni Triantafyllopoulou, Tim Julius Schulz, Raluca Aura Niesner与Anja Erika Hauser等研究人员共同完成。研究成果以题为“MarShie: a clearing protocol for 3D analysis of single cells throughout the bone marrow at subcellular resolution”的论文形式在《Nature Communications》期刊上发表。
重要发现
01论文的核心贡献与实验结论
本论文最核心的贡献是开发并验证了MarShie这一针对骨髓组织优化的整体透明化技术流程。该技术成功解决了骨髓成像中的两大核心难题：组织结构的完整保存与深部组织的光学透明。通过结合薄层光显微技术（LSFM），研究团队首次实现了在完整小鼠股骨中，对从骨内膜到骨髓腔最深处所有区域的细胞进行三维成像，分辨率达到了单细胞乃至亚细胞级别。
实验过程始于对小鼠股骨样本的精心处理。MarShie协议的核心步骤包括：采用SHIELD环氧化物进行灌注固定，以构建稳定的组织支架；使用EDTA进行温和脱钙，去除骨骼的无机成分；通过电动力学方法促进骨髓的均匀脱脂；最后利用Quadrol进行高效脱色。这一系列操作确保了骨髓结构在透明化过程中不发生肿胀或收缩，完整保留了细胞间的空间关系。研究证实，经过MarShie处理后的股骨，在785纳米波长下光学透射率超过90%，为深部成像提供了必要条件。
03多色荧光成像与信号增强
在成像能力方面，研究团队验证了MarShie技术与多种荧光信号的兼容性。他们使用了CX3CR1-GFP x Cdh5-tdTomato/histone-GFP等多种报告基因小鼠模型，成功检测了内源性GFP、tdTomato等荧光蛋白信号。针对GFP信号在深部骨髓中较弱的问题，他们引入了基于纳米抗体的信号增强技术（anti-GFP-Atto647N nanobooster），将信号波长转移至远红光范围，显著提升了信噪比（SNR）。在深部骨髓区域，Atto-647N信号的信噪比高达20.3，远优于未增强的GFP信号（SNR=4.0），这使得即使像细胞树突状突起这样的精细结构也能被清晰分辨。
04图像预处理与人工智能分割
针对薄层光显微镜成像中因骨骼散射和吸收产生的条纹伪影，研究团队开发了一种定向快速傅里叶变换（FFT）去条纹算法。该算法根据显微镜照明光路的方向性，在傅里叶空间构建特异性滤波器，能够有效抑制条纹伪影，同时保留样本的结构细节和空间分辨率（经测量，去条纹前后线剖面分辨率均为约2.1微米）。经过预处理的图像质量足以支持后续的机器学习分析。
利用LABKIT软件中的随机森林分类器，研究团队对血管网络（Cdh5-tdTomato信号）和特定细胞类型（如CX3CR1+髓系细胞）进行了精确的三维分割与量化。通过计算分割结果与人工标注之间的交并比（IoU），验证了该自动分割算法的可靠性（IoU值约为0.65-0.68），与专业人员标注的一致性相当。这一技术流程使得对骨髓内细胞密度、空间分布及其与血管距离的定量分析成为可能。
创新与亮点
01突破的成像难题
MarShie技术突破了过去骨髓三维成像的多个关键瓶颈。首先，它解决了脆弱骨髓组织在透明化过程中结构塌陷或变形的难题，首次实现了在完整长骨中对骨髓腔全范围结构的无损保存。其次，它克服了骨髓深部区域由于血红蛋白等色素造成的光吸收和散射问题，通过优化的脱色步骤，使光能够穿透至骨髓腔中心区域。最后，它通过创新的图像预处理和机器学习方法，解决了在复杂背景下对单个细胞进行自动、精确识别和分割的挑战。
在技术层面，MarShie的亮点在于其高度的集成性和通用性。它不仅兼容内源性荧光蛋白报告基因，还支持通过静脉注射抗体进行体内细胞标记（如CD31、CD169），并允许利用二次谐波成像（SHG）对胶原等结构进行无标记观察。这种“多模态”成像能力降低了对特殊转基因小鼠模型的依赖，拓宽了技术的应用范围。此外，经过MarShie处理的样本其荧光信号可稳定保存长达六个月，为样本的长期保存和重复测量提供了便利。
03光学生物医疗价值
从生物医学价值来看，MarShie技术为我们打开了一扇窥探骨髓“黑箱”内部微观世界的高清窗口。研究团队利用该技术取得了重要的生物学发现：例如，清晰地揭示了衰老小鼠骨髓中中央静脉窦体积的显著萎缩以及皮质骨内出现异位骨髓岛的年龄相关性变化。在骨骼损伤模型中，该技术能够动态、三维地展示损伤后髓系细胞的聚集、血管新生以及细胞与血管相互作用的时空过程。这对于研究造血干细胞niche、免疫细胞动力学、骨相关疾病（如骨质疏松、骨髓瘤）的病理机制以及组织再生医学都具有不可估量的价值，有望推动骨髓生物学研究进入一个全新的定量化、空间化时代。
总结与展望
综上所述，MarShie技术通过其卓越的组织保存能力、深部透明化效果和高分辨率成像兼容性，成功建立了一套用于完整长骨骨髓三维分析的标准化流程。该项工作不仅是技术上的创新，更通过具体的生物学应用实例，如揭示年龄相关的血管结构变化和损伤修复过程中的细胞动态，证明了其强大的实用价值。该技术将光学工程、图像信息学与骨髓生物学紧密结合，为在单细胞水平上无偏地、定量地研究完整器官级的细胞生态系统提供了强大工具。展望未来，MarShie技术框架有望被广泛应用于人类骨骼样本分析、其他硬组织研究以及更广泛的生物医学领域，从而深化我们对骨髓在健康与疾病状态下功能的理解，并为开发新的治疗策略提供前所未有的空间洞察力。
声明：本文仅用作学术目的。
Mertens TF, Liebheit AT, Ehl J, Köhler R, Rakhymzhan A, Woehler A, Katthän L, Ebel G, Liublin W, Kasapi A, Triantafyllopoulou A, Schulz TJ, Niesner RA, Hauser AE. MarShie: a clearing protocol for 3D analysis of single cells throughout the bone marrow at subcellular resolution. Nat Commun. 2024 Feb 26;15(1):1764.
DOI:10.1038/s41467-024-45827-6.