本文要点：准确识别肝癌切除手术中的肿瘤边界对于改善患者预后和减少术后并发症至关重要。本研究探讨了一种新型半乳糖靶向纳米荧光探针（Gal–OH-BDP NPs，简称GOB NPs）在动物原位肝细胞癌模型中实现近红外二区荧光成像的可行性。在动物原位肝癌模型中进行的活体近红外一区/二区成像显示，瘤内注射GOB NPs能实现其在肝癌组织中的靶向富集。GOB NPs的近红外二区成像在肿瘤部位展现最高荧光强度，具有最高的肿瘤/正常肝组织信噪比和最优的肿瘤边界分辨能力。经静脉注射后，GOB NPs显示出阴性染色特征，从而清晰勾勒出肿瘤边界，在肿瘤与肝组织间形成鲜明对比。研究结果证实，这种半乳糖靶向的近红外二区纳米探针不仅能通过靶向作用精准区分肿瘤与正常组织，还能在深层组织中保持显著的对比度优势。这种性能特点使其在临床肝癌精准切除术中具有重要的应用潜力。基于此，GOB NPs为提升肝癌手术的精确度提供了新的技术解决方案。

方案1. Gal–OH-BDP NPs结构及NIR-II成像示意图

在不使用脂肪乳溶液的情况下，装有GOB NPs水溶液的毛细管在近红外二区窗口测得的半高全宽值为522.90±2.64 μm，这清晰地勾勒出毛细管轮廓。而装有ICG水溶液的毛细管在近红外一区和近红外二区窗口的FWHM值分别为557.60±16.22 μm和525.40±9.17 μm。随着沉浸深度增加，组织吸收和散射效应变得明显。GOB NPs水溶液毛细管在近红外二区窗口的FWHM值随2、5、8、11毫米深度依次增至1672.66±34.52 μm、2496.64±25.82 μm、3815.70±169.12 μm和5159.43±59.13 μm（图1A）。当沉浸深度为8毫米时，毛细管轮廓仍保持可见。对于ICG水溶液毛细管，在近红外二区窗口的FWHM值随2、5、8、11毫米深度分别达到2277.49±63.38 μm、3443.93±34.99 μm、4919.09±115.64 μm和5218.40±28.74 μm（图1B）。在近红外一区窗口，ICG水溶液毛细管在2、5、8、11毫米深度的FWHM值依次为4990.79±61.34μm、5228.48±66.10 μm、5275.77±57.70 μm和5252.94±81.65 μm（图1C）。其近红外二区荧光图像的最大可识别深度为5毫米。当沉浸深度达到2毫米时，ICG水溶液毛细管的近红外一区荧光图像清晰度显著下降至几乎无法分辨的程度。

图1. 体外毛细管荧光成像

当覆盖2、5、8及11毫米不同厚度的鸡胸组织时，装载GOB NPs水溶液的毛细管在近红外二区窗口的半高全宽值分别为939.85±49.31 μm、1923.54±50.14 μm、3771.95±286.18 μm和5996.67±258.70 μm（图1D）。同样地，在相同鸡胸组织厚度条件下，装载ICG水溶液的毛细管在近红外二区窗口的FWHM值分别为1471.60±49.27 μm、3112.21±142.69 μm、5776.92±236.61 μm和6119.07±188.00 μm（图1E）。在近红外一区窗口，装载ICG水溶液的毛细管在相同组织厚度下的FWHM值则分别为3155.22±127.63μm、4748.15±376.32 μm、5928.54±142.08 μm和6242.55±106.63 μm（图1F）。与脂肪乳浸没成像结果一致，GOB NPs水溶液在近红外二区窗口的最大成像深度为8毫米；而ICG水溶液在近红外二区窗口的最大成像深度为5毫米，在近红外一区窗口仅为2毫米。这些数据进一步证实了GOB NPs相较于ICG在组织穿透性方面的显著优势。

图2. 病理毒性研究

在瘤内注射GOB NPs后，在白光下观察到肿瘤内快速染料扩散（图2A，B），通过NIR-II成像获得的荧光信号与肿瘤的视觉轮廓相关（图2C）。病理结果显示荧光图像信号与肿瘤的实际边界一致（图2D，E），从而证实了肝癌组织中GOB NPs的靶向聚集。

图3. 肿瘤与正常肝组织比值比较及亚组分析

静脉注射ICG 72小时后采集近红外一区/二区图像（图3A-C），瘤内注射GOB NPs后采集近红外二区图像（图3D-E）。对肿瘤近红外荧光图像进行定量分析，采用肿瘤/正常肝组织信噪比（TNR）指数量化肿瘤与正常肝组织的视觉对比度。在无鸡胸组织覆盖条件下，三组间TNR存在统计学显著差异（F=48.945, p<0.001）：近红外二区GOB组（TNR=5.12±1.06, n=10）的TNR值显著高于近红外二区ICG组（TNR=3.03±0.68, n=10；均值差=2.10, 95% CI [1.25, 2.94], p<0.001）和近红外一区ICG组（TNR=1.80±0.38, n=10；均值差=3.32, 95% CI [2.47, 4.16], p<0.001）；同时近红外二区ICG组较近红外一区ICG组仍具显著优势（均值差=1.22, 95% CI [0.38, 2.06], p<0.01）（图3F）。

对TNR三组分的亚组分析（肿瘤部位荧光、正常肝组织背景荧光及环境背景荧光）显示：近红外二区GOB组的肿瘤区域荧光强度（224.31±6.41）显著高于近红外二区ICG组（203.71±14.88）和近红外一区ICG组（146.56±33.48）（F=35.188, p<0.001）；在正常肝组织背景荧光方面，近红外一区ICG组背景荧光最高（88.83±24.76），近红外二区GOB组（45.94±7.68）显著低于近红外二区ICG组（70.01±12.13）（均值差=-24.07, 95% CI [-42.40, -5.75], p<0.01），组间差异具有统计学意义（F=16.923, p<0.001）；环境背景荧光分析表明，在相同成像设备和激发条件下，近红外二区GOB组（0.88±0.44）与近红外二区ICG组（0.54±0.26）无显著差异（均值差=0.34, 95% CI [-0.01, 0.68], t=2.055, p>0.05），而近红外一区ICG组因设备无滤光片且成像波长较短，环境背景荧光更高（11.11±5.07），与近红外二区GOB组（均值差=10.23, 95% CI [6.85,13.61], t=6.358, p<0.001）和近红外二区ICG组（均值差=10.57, 95% CI [7.19,13.94], t=6.583, p<0.001）均存在显著差异（图3G）。

图4. 荧光图像中肿瘤边缘分辨率的比较

通过计算肿瘤边缘像素的灰度值变化率量化肿瘤边缘分辨率。分析显示：近红外二区GOB组的灰度值变化率最高（160.11±23.31, n=10），显著优于近红外二区ICG组（101.17±18.29, n=10；均值差=58.94, 95%置信区间[39.33,78.54], p<0.001）和近红外一区ICG组（36.83±7.76；均值差=123.27, 95%置信区间[103.67,142.89], p<0.001），组间差异具有统计学意义（F=121.572, p<0.001）。在使用相同成像设备与激发条件的两组间对比中，近红外二区GOB组较近红外二区ICG组在肿瘤部位呈现更高荧光强度（253.48±12.93 vs 218.10±22.14；均值差=35.39, 95%置信区间[18.36,52.42], t=4.365, p<0.001），且邻近肝组织背景荧光更低（93.37±15.62 vs 116.92±12.57；均值差=-23.55, 95%置信区间[-36.86,-10.23], t=-3.715, p<0.01）（图4C）。

在鸡胸组织不同厚度覆盖条件下进行瘤内注射GOB NPs后获取近红外二区图像，静脉注射ICG 72小时后获取近红外一区/二区图像（图4A-B）。当覆盖2毫米鸡胸组织时，近红外一区ICG组的肿瘤区域荧光信号显著衰减（TNR降至1.48±0.29, n=10），导致肿瘤边缘在荧光图像中几乎无法辨识；而近红外二区GOB组的TNR（3.62±0.98, n=10）显著高于近红外二区ICG组（2.20±0.57, n=10；均值差=1.42, 95% CI [0.67,2.16], p<0.001）和近红外一区ICG组（均值差=2.13, 95% CI [1.39,2.88], p<0.001），组间差异具有统计学意义（F=26.014, p<0.001）。

当组织厚度增至5毫米时，近红外一区ICG组肿瘤轮廓完全消失（TNR=1.10±0.06），近红外二区GOB组的TNR（2.76±0.86）仍显著优于近红外二区ICG组（1.56±0.22；均值差=1.20, 95% CI [0.63,1.77], p<0.001）（F=27.804, p<0.001）。组织厚度达8毫米时，近红外二区ICG组TNR降至1.22±0.19，与近红外一区ICG组（1.09±0.12）均无法检测肿瘤信号（组间无显著差异：均值差=0.14, 95% CI [-0.31,0.58], p>0.05）；而近红外二区GOB组仍维持1.97±0.65的TNR（保留微弱肿瘤荧光可视性），与近红外二区ICG组（均值差=0.74, 95% CI [0.30,1.19], p<0.01）及近红外一区ICG组（均值差=0.88, 95% CI [0.44,1.32], p<0.001）差异显著。当组织厚度增至11毫米时，三组均无法检测肿瘤信号，组间无统计学差异（F=1.592, p>0.05）（图4D）。

图5. 静脉注射GOB-NPs对原位肝细胞癌的阴性染色

后续观察到静脉注射GOB NPs后其在正常肝实质与肝脏肿瘤的摄取情况（图5A）。注射后24小时成像显示肝肿瘤区域呈现"阴性染色"特征：肿瘤部位无荧光信号，而正常肝实质呈现强荧光，形成鲜明视觉对比（图5B）。这种对比模式在伴有肝内转移灶的大型肝癌（图5C）及小型肝癌（图5D）中均表现显著。定量分析表明肝/肿瘤对比度达2.33±0.56（n=3）；近红外二区荧光信号边界处高荧光与低荧光区域的病理结果证实，静脉注射GOB NPs产生的阴性染色成像可有效区分肿瘤与正常肝实质，从而精确定位肿瘤边界。

本研究通过联合新型GOB NPs荧光探针与瘤内注射策略，显著提升原位肝癌成像质量，使近红外二区GOB组获得最高肿瘤/正常肝组织信噪比（TNR=5.12），较近红外二区ICG组（TNR=3.03）和近红外一区ICG组（TNR=1.80）实现对比度突破性优化。该策略通过增强肿瘤区荧光强度（224.31±6.41 vs 203.71±14.88）与抑制肝背景荧光（45.94±7.68 vs 70.01±12.13），结合肿瘤边缘灰度变化率提升至160.11±23.31（较ICG组提高58%），实现术中肿瘤边界毫米级精准勾勒。GOB NPs在近红外二区发射峰赋予8毫米深部组织探测能力，其静脉注射后基于库普弗细胞分布差异产生独特"阴性染色"特征（肝/肿瘤对比度2.33±0.56），而瘤内注射激活受体靶向正对比成像，双模式协同为肝癌手术提供全病灶可视化解决方案，既能精确定位原发灶又能筛查转移灶，显著提升肿瘤全切率并降低术后复发风险。未来研究需聚焦GOB NPs的临床转化，包括优化生产工艺、建立严格质控标准及制定标准化生物安全评价体系，旨在为肝癌精准外科手术提供可靠创新的成像工具。

参考文献

Liu Z, Zeng T, Dang H, et al. Precision Visualization of Surgical Margins and Depth Imaging Performance in Orthotopic Hepatocellular Carcinoma Using Galactose-Targeted NIR-II Fluorescence Nanoprobe[J]. Analytical Chemistry, 2025，97, 30, 16619–16627.

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