肉类颜色测量指南之肌红蛋白和肉色的研究
2025-12-10 来源:本站 点击次数:94
肉类颜色测量指南
肌红蛋白和肉色的研究
本指南中的大部分章节涉及视觉或分光光度分析。本节将重点介绍实验室分析，例如肌肉pH和肌红蛋白浓度，这些分析有助于表征骨骼肌中的颜色化学。可能需要额外阅读文献以正确应用和解释这些程序的数据。肌红蛋白化学在第二节中进行了总结，但许多其他肉类颜色和肌红蛋白化学的综述及书籍章节也有助于加深对这些程序的理解。本节描述了各种实验室检测和测量的程序，并随后列出一个或多个推荐的分析方案。
A. 新鲜肉类研究
1. pH。 肉类pH可能是影响新鲜和熟肉颜色的最重要单一因素。因此，肉类颜色研究中应报告pH值。当pH从5.6增加到8.5时，肌红蛋白氧化（及褐变）显著受到抑制（Shikama和Sugawara，1978；Yin和Faustman，1993）。肉色素的溶解度也受到肉pH的显著影响。因此，提取溶液被缓冲至pH6.8，以从肉样中获得最大肌红蛋白和血红蛋白产量（Warriss ， 1979）。 此外 ，在制备纯化肌红蛋白时，离心和透析步骤中使用pH8.0至8.5的缓冲溶液，以最小化肌红蛋白氧化（Faustman和Phillips，2001）。
烹饪过程中肌红蛋白的变性在pH>6.0时也显著降低（Trout，1989），这解释了由高pH、深色切割牛肉制成的熟牛肉饼持续粉红的现象（Moiseev和Cornforth，1999）。相反，当pH降至5.5–5.7、牛肉饼在烹饪过程中过早变褐会增加，因为较低的pH有利于MMb的形成（Hunt等人，1999）。
第XI-A节推荐用于测量预僵化肉的pH值，使用碘乙酸抑制糖酵解并防止乳酸进一步产生。第XI-B节推荐用于后僵化肌肉或熟肉制品。越来越多的研究人员还使用配备穿透性pH探头的便携式仪器测量单个肌肉的pH值。与所有pH测量一样，该设备必须根据制造商的说明进行校准，使用标准溶液。感兴趣的pH范围（通常为4.0至7.0）。校准溶液应处于或接近 实际样品温度 。
2. 新鲜肉类中的总色素含量。 肉类色素含量之所以备受关注，一方面与肉色深浅密切相关，另一方面从营养学角度看，它能反映血红素铁的含量。肉类是重要的铁质来源，但不同形态的铁元素在生物利用率和引发氧化反应的潜力上存在差异。因此，准确测定肉类中血红素铁与非血红素铁的含量可能具有重要价值（卡彭特 和克拉克，1995）。
染料提取和分光光度法（透射或吸收）是测定总肌红蛋白和血红蛋白浓度的首选方法。第十一节-C描述了一种在pH 6.8的冷磷酸盐缓冲液中提取肉类色素的方法（Warriss，1979）。 通过添加亚硫酸氢钠将所有色素转化为还原、去氧形式（Hunt等人，1999）。色素浓度通过去氧色素在433 nm（Soret峰）处的吸光度测定。第十一节-D描述了一种类似的在冷磷酸盐缓冲液中提取肉类色素的方法，但总色素浓度通过525 nm处的吸光度测定，这是三种肌红蛋白形式的等峰点。第十一节-D基于 Krzywicki（1979）的方法，经 Trout（1989）修改，并由Tang、Faustman和Hoagland（2004）进一步改进。为测量肉表面肌红蛋白形式的相对比例，推荐Tang等人（2004）的更新方法。然而，对于溶液中总色素浓度的测定，两种方法可得出等效结果。Trout（1989）和Tang等人（2004）的总Mb公式仅在Mb 分子量 的数值上略有不同。
可溶性肉色素总量也可采用Drabkin（1950）的经典方法进行测定 。色素提取方法如先前所述（Warriss，1979），使用pH 6.8的0.04 M磷酸盐缓冲液以最大限度提取正常pH肉中的色素，或使用pH低于6.8的缓冲液以防止高pH肉产生浑浊的色素提取物（de Duve，1948；Hunt和Hedrick，1977）。 随后向部分提取液中加入铁氰化钾和氰化钾，将色素转化为氰化高铁肌红蛋白形式 。
通过分光光度法可测定肌红蛋白浓度 ，使用氰化高铁肌红蛋白在540 nm处的吸收系数 11.3mM⁻¹ cm⁻¹ 及肌红蛋白分子量17,000（Drabkin，1950）。所有肉类（新鲜、熟食、或腌制）的总血红素色素含量 可通过将血红素组分提取到酸化丙酮中形成血红素（氯化铁原卟啉；Hornsey，1956），如第XI-E和XI-F节所述。
卡尔松和伦德斯特伦（1991）采用温和试剂（氢氧化钠和Triton X-100）提取血红素，最终获得碱性血红素（铁原卟啉氢氧化物）。
根据样本在575 nm处的吸光度，与碱性血红素标准曲线进行比较，测定肌红蛋白浓度。
3. 分离肌红蛋白与血红蛋白。骨骼肌的粗提物常被用于肌红蛋白研究，但为减少其他可溶性肌浆蛋白和酶的影响，通常需要使用100%纯度的肌红蛋白。
在第XI-G节中，福斯特曼和菲利普斯（2001年）详细描述了一种通过硫酸铵沉淀法从肌肉组织中提取血红素色素的方法，并采用凝胶过滤层析法将肌红蛋白与血红蛋白分离。该方法适用于从多种动物物种中纯化肌红蛋白，仅需少量硫酸铵沉淀初始水平的改变。 可通过测定纯化组分的蛋白质含量 ，并考虑初始样品重量和稀释因子来测定肌红蛋白和血红蛋白浓度。
高压液相色谱法（HPLC）还可用于定量分析总血红素色素及肌红蛋白与血红蛋白的分配情况（奥林格拉特等 人，1990年）。特劳特和古兹克（1996年）提出了一种 HPLC 方法：通过计算280纳米处的色谱峰面积百分比来测定肌红蛋白占总蛋白的比例，同时通过525纳米处的色谱峰面积百分比来确定肌红蛋白占血红素蛋白的比例 ，从而实现肌红蛋白的分离与纯度测定。
4. 肌红蛋白形态的相对比例 。
肉品表面肌红蛋白形态（肌红蛋白原、肌红蛋白、肌红蛋白原结合态和肌红蛋白结合态）的相对比例 会显著影响肉品色泽和零售接受度。例如，当零售牛肉产品表面肌红蛋白原结合态比例超过40%时，消费者接受度会大幅下降（格林等人，1971年）。 肉品表面肌红蛋白形态的相对比例通过第九节所述的反射率测量法 进行测定。 细胞匀浆液中肌肉样本的肌红蛋白形态比例则通过其对应峰的吸光度进行测量（特劳特，1989年；唐等人，2004年）。
提取技术很少能阻止肌红蛋白的一种形式转化为另一种形式，也无法提供溶液中氧化还原稳定性的可靠信息。Krzywicki（1982）采用特殊的预防措施和提取条件，以尽量减少MMb的变化；
他在低温下进行萃取，并用缓冲液控制pH值。即便如此，OMb和DMb的比例仍发生了一些变化。Krzywicki的方程（Krzywicki，1982）被广泛用于估算 溶液中肌红蛋白不同氧化还原形式的相对比例。有时，这些方程会为某些氧化还原形式生成负值 ， 有时通过将三种氧化还原形式的总和获得的估计值超过100%。这主要是由于在这些方程中选择了不合适的波长（545、565和572nm）。为了解决这个问题，Tang等人（2004）使用了503 nm的波长最大值来处理MMb，557 nm用于DMb，582 nm用于OMb（图10.1）。修订的方程在处理负值和总和达到100%方面表现更好（第IX节）。
5. 溶液中COMb与OMb的鉴别方法。
如图10.2所示，樱桃红色氧化还原态 COMb与OMb的吸光度光谱高度相似。传统肌红蛋白氧化还原态估算公式（Krzywicki，1982；Tang等，2004）未考虑COMb的存在。若用这些公式测定纯COMb溶液中棕色色素（MMb）的生成量，会导致负值等错误结果 ，甚至出现总和超过100%的情况。为此，研究者采用A503/A581比值作为褐变指数，该指标可间接反映MMb的生成量（Suman等，2006）。通过分裂比色皿中COMb 、 OMb 与MMb的组合实验 ，验证了该褐变指数的有效性。
Nam和Ahn（2002年）研究发现，有氧包装火鸡胸肉滴液中的OMb（氧化甲基苯）在541和576纳米处呈现 β 和 α 特征峰，经辐照处理后，这些特征峰分别向短波长方向移动至536和566纳米。研究人员还通过反射光谱技术区分了OMb与COMb。气相色谱分析证实辐照样品中产生了CO。
因此，COMb是辐照火鸡胸肌中粉红色色素的来源（Nam和 Ahn，2002）。马OMb的 β 和 α 峰分别位于544和582纳米处（Bowen，1949），而COMb的峰则略微向短波长方向偏移（540或541纳米和577纳米）（Bowen，1949；Sørheim等人，2006）。
虽然理论上可以基于400至700nm的特征光谱区分COMB和OMb，但目前 无法确定暴露于一氧化碳和二氧化氧的肉样中它们的相对比例。
6. 线粒体耗氧量。 线粒体活性在死后肌肉耗氧量中起着重要作用，影响肌红蛋白氧合速率和颜色稳定性。随着肌肉死后年龄的增加，线粒体活性有下降趋势。高储存温度和高pH值会显著影响死后线粒体活性（Cheah和Cheah，1971；Ashmore等人，1972；Bendall和Taylor，1972；Cornforth和Egbert ，1985）。 肉类消耗的氧气会影响肌红蛋白氧合因为线粒体酶和肌红蛋白之间存在对可用氧气的竞争。随着死后线粒体活性的下降，肌红蛋白氧合速率更高。在肉类中，许多细胞过程和细胞器对可用氧气的竞争会影响肌红蛋白的氧化还原稳定性和MMb 的减少（Ramanathan等人 ， 2009）。第XI节 - H描述了分离线粒体的方法 ，第XI-I节描述了测量线粒体耗氧率的方法。
此外，骨骼肌的线粒体含量因生理来源不同而存在差异，导致相对耗氧率（OCR）、 肌红蛋白氧化还原形态 在表层与深层的分布，以及肉色稳定性等方面存在差异。新鲜肉类在储存和展示过程中保持“鲜红”状态的能力也存在差异。
肌肉（阿特金森和福莱特，1973；胡德，1980；奥基夫和胡德，1982；雷内尔和拉巴斯，1987；曼奇尼和亨特，2005）研究表明，线粒体含量较高的肌肉通常具有更高的氧化钙释放率（OCR），并能形成更多线粒体膜结合蛋白（MMb）。同样地，色素流失较快的肌肉往往颜色稳定性较差且OCR值较高（奥基夫和胡德 ，1982；雷内尔和拉巴斯，1987）。阿特金森和福莱特（1973）还指出，骨骼肌OCR值与色素流失速率呈正相关——OCR值越高，色素流失速率越快。通过测量OCR值，可以评估不同生理来源的尸体骨骼肌线粒体活性及其相对颜色稳定性。
肉类科学家已开发出多种客观检测方法来测定肌肉耗氧量和氧化偶联反应（OCR），包括瓦尔堡烧瓶法（Urbin和Wilson，1961）、差示呼吸测定法（DeVore和Solberg，1975）、克拉克氧电极法（Lanari和Cassens，1991；Ramanathan等，2009）、反射光谱法（Madhavi和Carpenter，1993）以及顶空氧分析仪（Sammel等，2002）。光线与肉类色素的相互作用为利用近红外（NIR ；700-1000纳米）技术检测肌红蛋白（Mb）的氧化还原动态提供了新思路。近期，Mohan团队（2010a）采用频域多距离（FDMD）NIR组织血氧仪，实现了对骨骼肌中肌红蛋白氧饱和度和OCR的实时、无创、直接测量。
7. 降肌红蛋白活性（MRA）。
测定MMb所用的方法学不同研究者对肉类活性降低（MRA）的评估存在显著差异（参见综述文章）（Bekhit和Faustman，2005）。测定 MRA 最常用的方法是首先诱导MMb的初始水平较高（通常通过在1%O大气或亚硝酸盐诱导氧化包装），随后进行促进MMb还原的检测步骤。通过分析肌肉中总MMb含量在还原步骤中的变化，可评估肌肉的还原能力。然而，肉类颜色研究者常质疑MMb含量变化呈现与解读的最佳方法是否可靠。
曼奇尼等人（2008年）研究了展示后 MRA 值在表层与深层区域的差异，并比较了包装氧浓度对这些区域差异及 MRA值的影响。他们还考察了还原甲基甲基溴（MMb）的四个测量指标——初始MMb形成量（IMF）、还原后MMb量（PRM）、绝对还原量与相对还原量 ——与颜色稳定性之间的关联。研究发现，这四个MMb/ MRA测量指标与可见表层颜色稳定性数据呈现正相关。研究者指出，不论是表层肌肉 还是 深层还原活性测量值，均未与表层颜色稳定性存在相关性。
他们发现，在他们的研究中使用的所有肌肉中，在牛排表面测量的传统绝对和相对 MRA 值与表面颜色的相关性最低 。
福斯特曼和卡森斯（1990年）同时报告了绝对有氧还原活性（ARA）和相对有氧还原活性（MRA）。奥基夫与胡德（1982年）提出，由于不同肌肉组织形成表面肌膜（MMb）的能力存在差异，相对 MRA 在预测肌肉颜色方面不如绝对 MRA 准确。麦肯纳等人（2005年）发现，当样本置于1%二氧化氧环境中时，部分肌肉组织会抑制表面肌膜的形成。他们通过诱导表面肌膜形成抵抗性（RIMF）指标，将肌肉还原能力与颜色稳定性相关联。
萨梅尔等人（2002年）的研究表明，一氧化氮对MMb的还原能力可用于测定还原活性。该研究团队指出，由于其方法最初采用温和氧化剂（硝酸钠）， 相较于使用铁氰化物的检测方法，这种方法可能为确定MRA 值提供了更实用的解决方案。金等人（2011年）沿用萨梅尔团队（2002年）的方法，监测 牛里脊肉排 在不同个体间的色泽稳定性差异。 研究发现，初始肉排耗氧速率 、经亚硝酸盐处理后的初始MRA值以及还原后MMb含量，是评估单个肉排色泽稳定性的关键指标。
第十一节 - J部分描述了一种测定完整肌肉切片中MMb还原能力的检测方法 ，该方法改编自Watts等人（1966年）的研究。具体操作时，将样本置于亚硝酸钠溶液中浸泡20分钟，使样本表面的肌肉色素首先被氧化生成MMb。随后将厚度为1.27厘米的切片真空包装，在30℃环境下通过测量 K/S 反射率比值（572/525纳米波长）持续监测表面MMb浓度，持续2小时。样本的还原能力定义为孵育期间表面MMb浓度的百分比下降值。第十一节-K部分则详细说明了对第十一节-J部分的改进方案，用于测定绞肉样本的MRA值（Sammel等人，2002年）。
第XI-L节描述了肌肉匀浆中 MRA 的快速（2分钟）测定法（Hagler等人，1979；Madhavi和Carpenter，1993年修改）。
将肌肉滤液+ NADH加入 荧光光度计比色皿中的MMb+铁氰化物 溶液中，启动反应。 在反应初始线性阶段（1至2分钟）内，通过OMb在580nm处吸光度的增加监测MMb还元酶活性。
8. 添加底物对 MRA（乳酸、苹果酸）的影响。
多位研究人员已对通过内源性酶系统促进MMb还原生成尼古丁酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的潜力产生兴趣，包括生化过程可能有助于维持肉品色泽稳定性。沃茨等人（1966）证实添加NAD可提升肉品的MRA值。当使用琥珀酸或细胞色素c c等底物时，电子传递过程可将这些物质转化为NAD。在特定底物条件下，细胞质中的多种脱氢1965能生成NADH。吉丁斯（1974，1977）提出线粒体或亚线粒体颗粒可参与还原肉品中的甲硫胺素（MMb），并推测线粒体通过提供关键还原辅因子 还原型 NADH（该物质既可由内源酶生成，也可通过逆转电子传递过程产生）来实现这一还原作用。
最近，Kim等人（2006）和Mohan等人（2010b）证明了添加从糖酵解（乳酸）或线粒体三羧酸途径（苹果酸）中获得的底物的效果。两项研究均报告了在向 完整肌肉或骨骼肌匀浆 中添加底物后，肉类的 MRA 得到改善。
B. 熟肉研究
肉类色素（肌红蛋白、血红蛋白）在烹饪过程中会发生变性，导致球蛋白结构解折叠。在有氧条件下，血红素铁极易被氧化，暴露的血红素可能与变性蛋白质形成复合物，包括肌红蛋白二聚体或聚集体（Tappel，1957；Ledward，1971）。这些灰褐色复合物被称为变性球蛋白半色素，其中“半”表示血红素铁处于氧化状态。尽管加热肌红蛋白（Mb）溶液时已采用可见光吸收光谱法，但研究熟肉色素时通常采用反射光谱法（Ledward，1971）。第XI-M节描述了一种检测需氧烹饪肉类（>76°C）中粉红色变性球蛋白半色素的反射光谱方法。需注意及时进行分析，因为这些色素在空气中会迅速褪色（Ghorpade和Cornforth，1992；Cornforth，2001）。
1. 持续性粉红现象与过早褐变——诊断方法。
消费者有时会对熟肉的粉红色感到敏感，怀疑产品可能未煮熟。因此，加工厂需要定期检测产品以确定 并消除或减少不希望出现的粉红现象。食材中亚硝酸盐或硝酸盐的污染 可能是导致粉红现象的原因之一（希顿等人，2000年）。可通过霍恩西（1956年）腌肉色素检测法进行排查（详见第XI-E和XI-F节）。 烤肉表面的粉红现象也会因接触燃烧废气中的二氧化氮而呈阳性反应（科恩福斯 等人，1998年）。燃烧废气中可能含有二氧化碳，但霍恩西（1956年）方法仅能检测NO-血红素复合物，无法识别CO-血红素复合物。
如果肉确实未煮熟，未变性的肌红蛋白含量将高于正常水平。肌红蛋白在pH>6.0时对热变性具有抵抗力，导致熟肉中的肌红蛋白浓度高于正常水平，并在内部温度达到80°C或更高时呈现红色或粉红色（Trout，1989；Moiseev和Cornforth，1999）。在另一个极端，Hague等人（1994）、Lavelle等人（1995）和Hunt等人。
(1999) 描述了氧化绞肉的过早褐变， 在烹饪过程中MMb变性的温度低于OMb或DMb 。 汉堡肉的过早褐变有食品安全影响，因为肉饼可能被视为在无法杀死食物病原体的烹饪温度下完全煮熟。
可溶性肌红蛋白可在磷酸盐缓冲液中提取，并如第XI - D节所述，使用分光光度计在525 nm处测量吸光度，即肌红蛋白的等渗点。根据物种和内部烹饪温度，煮熟的样品中可能残留部分可溶性肌红蛋白。pH值 > 6 . 0的肉类中可溶性肌红蛋白含量会高于正常水平。另一方面，过早褐变的肉类可溶性肌红蛋白含量低于正常水平，可能与低pH值有关。确定产品的pH值（第XI - B节）。
若未变性肌红蛋白或熟肉色素导致的粉红色无法确认，则应怀疑存在变性血红素色素。这些粉红色色素在罐装或慢炖锅烹饪等缺氧高温条件下形成，且需在水下进行。具体检测方法可参照第XI-M节 。
c. 熏制肉类研究
本节阐述了检测与定量分析熟肉及腌制肉色素及前体化合物的实验室方法。腌制肉通常添加亚硝酸钠或亚硝酸钾、硝酸盐进行配方处理，烹饪时会生成粉红色的腌制肉色素（单亚硝基血红素）。天然腌制肉中，腌制剂多为芹菜籽粉或海盐中的硝酸盐成分。 在烹饪前 ，通过微生物发酵将硝酸盐转化为 亚硝酸盐 。传统火烤干肉或烧烤肉制品中，一氧化氮气体在燃烧时会与湿润肉表面的水分反应生成亚硝酸根离子，从而引发烹饪过程中的表面粉化（腌制）现象。
1. 腌制肉着色剂。Erdman和Watts（1957）开发了一种有效的方法，通过监测570/650波长的表面反射率来跟踪腌制肉颜色的变化。该测量方法可用于指示真空泄漏包装或其他促进颜色褪色的条件 。
经固化处理的肉色素经基尔德等人鉴定为单硝基血红素。al.（1988年）通过质谱分析证实， 硝基化血红素的质量增加了30，这表明结合了一个NO基团（与先前报道的两个不同，如此）。作为血红素色素总量的百分比，用以衡量腌制工艺效果的 腌制肉色素含量（霍恩西，1956年）。由于血红素色素本身是与热使蛋白质变性形成的复合物，因此无法直接溶解 。 但 该NO基团可通过80%丙酮（根据样品含水量调整浓度）萃取，并通过540纳米波长的光谱分析进行定量（详见第XI-E和XI-F节）。
2. 总血红素和血红素铁含量。
总血红素含量可通过以下方法测定：将所有含血红素基团的物质萃取至80%酸化丙酮中，包括固化与未固化的色素，以及含血红素的酶类和辅因子（详见第XI-E和XI-F节）。
总血红素含量（以血红素计）通过A 640 法测定（Hornsey，1956）。固化过程中将血红素色素转化为亚硝基血红素形式的转化率低于80%通常被认为是可接受的（Pearson和Tauber，1984）。在Hornsey（1956）方法中，将10g样品混合在高烧杯中以防止过度蒸发。
皮尔逊和陶伯（1984）采用2克样品和带盖试管以防止通过蒸发处理，可同时分析更多样本。Carpenter和Clark（1995）采用5克样本。
使用Hornsey（1956）方法进行总血红素测定可评估肉类中血红素铁含量的营养价值（Carpenter和Clark，1995）。 湿法灰化后肉样中的总铁含量可通过铁嗪法测定（Carter，1971），其中 Fe²⁺ 与铁嗪结合形成红色色素，通过562nm波长的光谱法检测。非血红素铁含量可通过铁嗪法检测HCl-三氯乙酸提取物中的铁含量（Schricker等，1982）。不锈钢探针型匀浆器不宜用于盐酸 - TCA 中的样品匀浆，因为铁会从探针本身被提取，尤其是较旧、磨损的探针（Jayasingh，2004）。
3. 帕尔马火腿的红色素。
帕尔马火腿是意大利帕尔马地区传统发酵肉制品，通过长时间腌制猪后腿制成，且不添加硝酸盐或亚硝酸盐类腌制盐。莫里塔等人（1996）采用电子自旋共振光谱技术发现，帕尔马火腿的红色素与亚硝酸盐腌制肉的色素存在差异。他们进一步证实，从帕尔马火腿中分离出的葡萄球菌能从MMb（肌红蛋白）衍生出红色肌红蛋白。若松等人（2004）通过光谱分析、荧光检测，并运用HPLC 质谱和电喷雾电离高分辨质谱（ESI - HRMS）对帕尔马火腿的鲜红色素进行表征。 研究发现，这种红色 色素源自锌原卟啉IX，而非含铁血红素色素。
一氧化碳可使用非分散红外分析仪进行检测。该仪器通过两个独立能量源产生红外辐射。经斩波器调制的辐射脉冲频率为5赫兹，通过光学滤光片可有效抑制其他红外吸收物质的干扰。每束红外光束均通过独立检测池，其中一个检测池密封设计用于盛放标准气体。
另一单元则持续通入样品气体（CO），吸收的红外辐射量与CO浓度成正比 。
D. 包装尺寸
由于新鲜肉和加工肉的颜色受到与血红素结合的配体的深刻影响，而且包装在商业上用于最小化新鲜肉和加工肉的颜色变坏，包装在实验室分析中需要特别考虑。以下是分析期间包装样品的重要考虑因素。
1. 薄膜厚度。能够以密尔（1/100英寸；参见术语表）为单位测量厚度的数字式测微计，可用于测量薄膜和包装托盘的厚度。许多真空包装袋的厚度为2至3密尔，而用于新鲜零售肉类的氧气渗透性聚氯乙烯（聚氯乙烯）薄膜覆盖层通常厚度小于1密尔。一般来说，薄膜厚度越大，气体渗透性越低。较厚的薄膜也更昂贵。
2. 薄膜渗透性。对于鲜肉而言，高氧渗透性薄膜可维持氧合血红素色素（Landrock和Wallace，1955；Cornforth和Allen，2009）。极低氧渗透性薄膜（也称为高阻隔膜）会促使脱氧血红素色素的形成，因为肉的还原能力（Siegel，2007）。
当氧气分压较低（1至25毫米汞柱）时，会加速氧化反应并导致色素褐变（Kropf，2004），这种情况应尽量避免。表10.1展示了真空度从零（真空状态）到1个大气压（760毫米汞柱）时，不同真空度下大气压与氧气分压的变化 。其中特别标注了多数快速褐变的危险区域。使用常规真空包装机很难将氧气含量降至该范围以下，因此 肉类在消耗包装内残留氧气前 往往会 产生多聚肌肽（MMb）。相比之下，微气泡包装技术能通过 一次或多次向包装腔注入目标气体，比真空包装更有效地降低残留氧气水平。无论采用何种包装系统，都需谨慎控制以确保氧气分压足够低。
氧气，以确保肉质消耗残留氧气的能力不会被超出。
无论包装内真空度如何，残留气体的成分比例始终与空气基本一致：氮气78.1%、氧气20.9%、氩气0.9%、二氧化碳0.03%。不过，像氧气电极这样的传感器检测到的气体浓度，其实与产品周围的大气压成正比。举个例子，当真空度达到大气压一半时，可测得的氧气浓度为10.45%（104,500ppm），此时氧气分压为79.6毫米汞柱（380/760×159.2毫米汞柱；见表10.1）。包装膜的透气性对抑制氧气渗入同样关键，尤其是出口产品这类保质期较长的商品，更需要严防死守。
包装薄膜、袋子、和托盘的气体渗透性通常包括 水蒸气和氧气的渗透率。二氧化碳、一氧化碳和氮气的渗透率数据较少。
渗透率不仅随薄膜厚度变化，还受其他因素影响。研究报告应包含薄膜渗透率的相关信息。
3. 改良大气包装技术。 高氧阻隔包装膜可 结合多种顶空气体，有效调控并保存肉类中的色素形态。二氧化碳因其抗菌特性在改良大气包装中应用广泛。但氮气与二氧化碳对色素形态基本无影响，因此它们存在于改良大气包装顶空时不会改变肉品色泽（Moeller等，2004）。高氧环境有助于维持氧合血红素色素形态（Georgala和Davidson，1970；O‘Sullivan和Kerry，2010），但需注意肉品的呼吸能力，避免氧气消耗过量导致甲基甲蓝（MMb）生成（Bekhit和Faustman，2005）。若包装顶空存在一氧化碳或一氧化氮气体，或使用含亚硝酸钠晶体的包装膜，会形成反映这些化合物结合的色素形态（Siegel，2007,2009）。
4. 包装气体成分检测。 为验证MAP系统能否达到目标气体成分并确保储存期间成分稳定，需对包装内气体成分进行检测报告。由于肉类呼吸作用和气体吸收 ，MAP系统中的相对气体成分在包装保质期内会发生动态变化；因此，需要精准确定采样时间。通过自密封隔膜用注射器抽取包装样本，可借助顶空气体分析仪测定氧气、一氧化碳和二氧化碳浓度（Knock等人，2005；Mancini等人，2009 ；Raines和Hunt，2010）。
e. 脂质氧化对肉品色泽（新鲜、熟成、腌制）的影响
多数肉类色泽研究都会检测脂质氧化指标 ， 因为肌红蛋白氧化通常与脂质氧化密切相关 。 脂质氧化产生的醛类物质会引发肌红蛋白构象变化 ， 导致血红素氧化加剧并产生褐变（Alderton等，2003）。鱼类血红蛋白在储存过程中释放的血红素同样会刺激脂质氧化（Grunwald和Richards，2006）。类似地，加热过程中从血红素中释放的离子态铁也可能刺激脂质氧化 ， 这可通过硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）检测法进行测量（Igene等，1985）。脂质氧化程度可通过多种技术手段测定，包括挥发性氧化产物顶空分析（Watanabe等，2008）和感官评价，但在肉类制品中最常用的是 TBARS 检测法。TBARS检测法基于硫代巴比妥酸与脂质氧化醛产物（尤其是2,4-亚烷基二醛）反应生成粉红色显色剂的原理，该显色剂在530-535纳米波长处具有最大吸光度（Marcuse和Johansson，1973）。丙二醛（MDA）是用于 TBARS 标准曲线的化合物。该检测法可对多个样本进行快速检测，1天内即可得出结果，且 TBARS 值与感官测试结果高度相关。当 TBARS 值>1.0时，通常表明煮熟的肉样存在可检测的氧化性气味和风味（Greene和Cumuze，1981）Tarladgis等人（1960）开发了广泛使用的蒸馏法（第十一节 - P）， 具体操作是将 硫代巴比妥酸（TBA）溶液加入样品冷凝液中。为简化蒸馏步骤，可直接将TBA溶液加入肉样中，对未加热样本需等待数小时 使显色剂形成（Witte等人，1970），或如第XI-O节所述，通过10分钟煮沸处理（Buege和Aust，1978）。
在 TBARS 检测中，当存在大量脂类衍生醛类（Marcuse和Johansson，1973）及糖类（包括蔗糖，Du和Bramlage，1992）时，也会产生最大吸光度为453 nm的黄色显色剂。为消除糖类引发的黄色干扰，Du和Bramlage（1992）开发了改良方法，采用MDA和蔗糖的标准曲线进行校正。另一种解决方案是采用Tarladgis等人（1960）的原始蒸馏法处理含葡萄干（含糖量70%）的肉样，由于糖醛类化合物不挥发，不会被样品冷凝液捕获，从而避免了黄色显色现象（Vasavada和Cornforth，2006）。
在腌制肉制品中， TBARS 值会受到残留亚硝酸盐的影响。为此，Zipser和Watts（1962年）改进的 TBARS 测定法会在 蒸馏前向腌肉样品中添加磺胺类化合物，以防止残留亚硝酸盐引发丙二醛亚硝化反应导致的误判 。但值得注意的是，磺胺类化合物的添加本身也会改变 TBARS 值。实验数据显示，当亚硝酸盐浓度为100-200ppm时，添加磺胺类化合物的腌肉 TBARS 值始终高于未添加组。然而在0-50ppm的低浓度亚硝酸钠条件下，磺胺类化合物的存在反而会使 TBARS 值持续降低（Shahidi等，1985年）。
F. 基础研究方法
1. 肌红蛋白的质谱表征技术。肉品色泽稳定性受多种内在与外在因素影响，包括物种特异性差异、红白肌纤维分布特征及肌红蛋白化学特性。 质谱分析作为蛋白质结构表征的关键工具，在肉类科学领域已展现出在肌红蛋白功能特性研究中的巨大应用潜力。为探究肉品色泽的物种特异性差，Joseph等人（2010a）采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术开展研究。
采用质谱法对野牛肌红蛋白进行表征；约瑟夫等人（2010a）对火鸡肌红蛋白进行表征；苏曼等人（2010）对鸸鹋肌红蛋白进行表征。
蛋白质和肽是肌肉食品的主要成分，对烹饪过程中食品蛋白质的结构变化至关重要。食品蛋白质组学已开始影响食品链的诸多环节，包括食品生产、食品安全和质量控制。近年来，质谱技术的应用彻底改变了蛋白质特征分析、氨基酸测序以及细菌蛋白质指纹图谱的研究。 蛋白质组学的最新 进展为肉类科学家提供了新机遇，使他们能够深入探究食材相互作用的分子机制，从而优化肉类色泽及其稳定性研究。
曼奇尼团队（2010年）运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，揭示了乳酸影响牛肉色泽稳定性的作用机制。通过质谱分析，科研人员能够系统研究原料间的相互作用、加工过程引发的改变，并精准定位食品链中最易出现质量问题、微生物污染和营养流失的环节。尽管食品蛋白质组学在肉类科学领域尚属新兴领域，但这项技术已为改善人类健康作出重要贡献 。
2. 氧代谢检测技术用于测定包装肉中肌红蛋白形态的相对浓度。 肉类色泽的生化因素研究已持续数十年，但鲜有研究聚焦于开发非侵入性方法 / 技术，以快速实时评估肉类整体品质。尽管该领域已取得显著进展，现有表征肉色参数和预测肉色稳定性的技术 仍存在局限性——这些方法具有侵入性、耗时费力且仅能间接反映肌红蛋白的氧化还原状态。类似地，用于表征组织结构的检测技术（如耗氧量和线粒体活性相关技术）也存在相同缺陷。肉类中光与肌肉色素的相互作用为开发近红外（NIR）检测肌红蛋白氧化还原动态的方法提供了新思路。700至1000纳米技术。
近红外光谱（NIRS）已被广泛用于 医学诊断和运动生理学中确定肌红蛋白和血红蛋白的氧吸收（Ferreira等人，2005）。 NIRS 是一种无创、连续和快速（25至35秒）评估肉类表面和亚表面水平氧合和脱氧肌红蛋白绝对浓度的方法（Mohan等人，2010a）。
基于 NIRS 光-组织相互作用的基本方法 能实时提供关于肉类光学特性和吸收模式的宝贵信息，同时定量分析肉表面及次表层的肌红蛋白氧化还原形态。由于 NIR 光能深入穿透如肉类等生物组织，NIRS 技术有望成为非侵入性大视场成像 死后肌肉研究的有效手段。 由于肌红蛋白与血红蛋白在 NIR 波段吸收波长相同， 同一方法也可用于测定 肉类肌红蛋白的氧化还原稳定性及其他结构特征，这将最终帮助我们理解后处理工艺对肌红蛋白化学性质的影响。
肌红蛋白和肉色的研究
本指南中的大部分章节涉及视觉或分光光度分析。本节将重点介绍实验室分析，例如肌肉pH和肌红蛋白浓度，这些分析有助于表征骨骼肌中的颜色化学。可能需要额外阅读文献以正确应用和解释这些程序的数据。肌红蛋白化学在第二节中进行了总结，但许多其他肉类颜色和肌红蛋白化学的综述及书籍章节也有助于加深对这些程序的理解。本节描述了各种实验室检测和测量的程序，并随后列出一个或多个推荐的分析方案。
A. 新鲜肉类研究
1. pH。 肉类pH可能是影响新鲜和熟肉颜色的最重要单一因素。因此，肉类颜色研究中应报告pH值。当pH从5.6增加到8.5时，肌红蛋白氧化（及褐变）显著受到抑制（Shikama和Sugawara，1978；Yin和Faustman，1993）。肉色素的溶解度也受到肉pH的显著影响。因此，提取溶液被缓冲至pH6.8，以从肉样中获得最大肌红蛋白和血红蛋白产量（Warriss ， 1979）。 此外 ，在制备纯化肌红蛋白时，离心和透析步骤中使用pH8.0至8.5的缓冲溶液，以最小化肌红蛋白氧化（Faustman和Phillips，2001）。
烹饪过程中肌红蛋白的变性在pH>6.0时也显著降低（Trout，1989），这解释了由高pH、深色切割牛肉制成的熟牛肉饼持续粉红的现象（Moiseev和Cornforth，1999）。相反，当pH降至5.5–5.7、牛肉饼在烹饪过程中过早变褐会增加，因为较低的pH有利于MMb的形成（Hunt等人，1999）。
第XI-A节推荐用于测量预僵化肉的pH值，使用碘乙酸抑制糖酵解并防止乳酸进一步产生。第XI-B节推荐用于后僵化肌肉或熟肉制品。越来越多的研究人员还使用配备穿透性pH探头的便携式仪器测量单个肌肉的pH值。与所有pH测量一样，该设备必须根据制造商的说明进行校准，使用标准溶液。感兴趣的pH范围（通常为4.0至7.0）。校准溶液应处于或接近 实际样品温度 。
2. 新鲜肉类中的总色素含量。 肉类色素含量之所以备受关注，一方面与肉色深浅密切相关，另一方面从营养学角度看，它能反映血红素铁的含量。肉类是重要的铁质来源，但不同形态的铁元素在生物利用率和引发氧化反应的潜力上存在差异。因此，准确测定肉类中血红素铁与非血红素铁的含量可能具有重要价值（卡彭特 和克拉克，1995）。
染料提取和分光光度法（透射或吸收）是测定总肌红蛋白和血红蛋白浓度的首选方法。第十一节-C描述了一种在pH 6.8的冷磷酸盐缓冲液中提取肉类色素的方法（Warriss，1979）。 通过添加亚硫酸氢钠将所有色素转化为还原、去氧形式（Hunt等人，1999）。色素浓度通过去氧色素在433 nm（Soret峰）处的吸光度测定。第十一节-D描述了一种类似的在冷磷酸盐缓冲液中提取肉类色素的方法，但总色素浓度通过525 nm处的吸光度测定，这是三种肌红蛋白形式的等峰点。第十一节-D基于 Krzywicki（1979）的方法，经 Trout（1989）修改，并由Tang、Faustman和Hoagland（2004）进一步改进。为测量肉表面肌红蛋白形式的相对比例，推荐Tang等人（2004）的更新方法。然而，对于溶液中总色素浓度的测定，两种方法可得出等效结果。Trout（1989）和Tang等人（2004）的总Mb公式仅在Mb 分子量 的数值上略有不同。
可溶性肉色素总量也可采用Drabkin（1950）的经典方法进行测定 。色素提取方法如先前所述（Warriss，1979），使用pH 6.8的0.04 M磷酸盐缓冲液以最大限度提取正常pH肉中的色素，或使用pH低于6.8的缓冲液以防止高pH肉产生浑浊的色素提取物（de Duve，1948；Hunt和Hedrick，1977）。 随后向部分提取液中加入铁氰化钾和氰化钾，将色素转化为氰化高铁肌红蛋白形式 。
通过分光光度法可测定肌红蛋白浓度 ，使用氰化高铁肌红蛋白在540 nm处的吸收系数 11.3mM⁻¹ cm⁻¹ 及肌红蛋白分子量17,000（Drabkin，1950）。所有肉类（新鲜、熟食、或腌制）的总血红素色素含量 可通过将血红素组分提取到酸化丙酮中形成血红素（氯化铁原卟啉；Hornsey，1956），如第XI-E和XI-F节所述。
卡尔松和伦德斯特伦（1991）采用温和试剂（氢氧化钠和Triton X-100）提取血红素，最终获得碱性血红素（铁原卟啉氢氧化物）。
根据样本在575 nm处的吸光度，与碱性血红素标准曲线进行比较，测定肌红蛋白浓度。
3. 分离肌红蛋白与血红蛋白。骨骼肌的粗提物常被用于肌红蛋白研究，但为减少其他可溶性肌浆蛋白和酶的影响，通常需要使用100%纯度的肌红蛋白。
在第XI-G节中，福斯特曼和菲利普斯（2001年）详细描述了一种通过硫酸铵沉淀法从肌肉组织中提取血红素色素的方法，并采用凝胶过滤层析法将肌红蛋白与血红蛋白分离。该方法适用于从多种动物物种中纯化肌红蛋白，仅需少量硫酸铵沉淀初始水平的改变。 可通过测定纯化组分的蛋白质含量 ，并考虑初始样品重量和稀释因子来测定肌红蛋白和血红蛋白浓度。
高压液相色谱法（HPLC）还可用于定量分析总血红素色素及肌红蛋白与血红蛋白的分配情况（奥林格拉特等 人，1990年）。特劳特和古兹克（1996年）提出了一种 HPLC 方法：通过计算280纳米处的色谱峰面积百分比来测定肌红蛋白占总蛋白的比例，同时通过525纳米处的色谱峰面积百分比来确定肌红蛋白占血红素蛋白的比例 ，从而实现肌红蛋白的分离与纯度测定。
4. 肌红蛋白形态的相对比例 。
肉品表面肌红蛋白形态（肌红蛋白原、肌红蛋白、肌红蛋白原结合态和肌红蛋白结合态）的相对比例 会显著影响肉品色泽和零售接受度。例如，当零售牛肉产品表面肌红蛋白原结合态比例超过40%时，消费者接受度会大幅下降（格林等人，1971年）。 肉品表面肌红蛋白形态的相对比例通过第九节所述的反射率测量法 进行测定。 细胞匀浆液中肌肉样本的肌红蛋白形态比例则通过其对应峰的吸光度进行测量（特劳特，1989年；唐等人，2004年）。
提取技术很少能阻止肌红蛋白的一种形式转化为另一种形式，也无法提供溶液中氧化还原稳定性的可靠信息。Krzywicki（1982）采用特殊的预防措施和提取条件，以尽量减少MMb的变化；
他在低温下进行萃取，并用缓冲液控制pH值。即便如此，OMb和DMb的比例仍发生了一些变化。Krzywicki的方程（Krzywicki，1982）被广泛用于估算 溶液中肌红蛋白不同氧化还原形式的相对比例。有时，这些方程会为某些氧化还原形式生成负值 ， 有时通过将三种氧化还原形式的总和获得的估计值超过100%。这主要是由于在这些方程中选择了不合适的波长（545、565和572nm）。为了解决这个问题，Tang等人（2004）使用了503 nm的波长最大值来处理MMb，557 nm用于DMb，582 nm用于OMb（图10.1）。修订的方程在处理负值和总和达到100%方面表现更好（第IX节）。
5. 溶液中COMb与OMb的鉴别方法。
如图10.2所示，樱桃红色氧化还原态 COMb与OMb的吸光度光谱高度相似。传统肌红蛋白氧化还原态估算公式（Krzywicki，1982；Tang等，2004）未考虑COMb的存在。若用这些公式测定纯COMb溶液中棕色色素（MMb）的生成量，会导致负值等错误结果 ，甚至出现总和超过100%的情况。为此，研究者采用A503/A581比值作为褐变指数，该指标可间接反映MMb的生成量（Suman等，2006）。通过分裂比色皿中COMb 、 OMb 与MMb的组合实验 ，验证了该褐变指数的有效性。
Nam和Ahn（2002年）研究发现，有氧包装火鸡胸肉滴液中的OMb（氧化甲基苯）在541和576纳米处呈现 β 和 α 特征峰，经辐照处理后，这些特征峰分别向短波长方向移动至536和566纳米。研究人员还通过反射光谱技术区分了OMb与COMb。气相色谱分析证实辐照样品中产生了CO。
因此，COMb是辐照火鸡胸肌中粉红色色素的来源（Nam和 Ahn，2002）。马OMb的 β 和 α 峰分别位于544和582纳米处（Bowen，1949），而COMb的峰则略微向短波长方向偏移（540或541纳米和577纳米）（Bowen，1949；Sørheim等人，2006）。
虽然理论上可以基于400至700nm的特征光谱区分COMB和OMb，但目前 无法确定暴露于一氧化碳和二氧化氧的肉样中它们的相对比例。
6. 线粒体耗氧量。 线粒体活性在死后肌肉耗氧量中起着重要作用，影响肌红蛋白氧合速率和颜色稳定性。随着肌肉死后年龄的增加，线粒体活性有下降趋势。高储存温度和高pH值会显著影响死后线粒体活性（Cheah和Cheah，1971；Ashmore等人，1972；Bendall和Taylor，1972；Cornforth和Egbert ，1985）。 肉类消耗的氧气会影响肌红蛋白氧合因为线粒体酶和肌红蛋白之间存在对可用氧气的竞争。随着死后线粒体活性的下降，肌红蛋白氧合速率更高。在肉类中，许多细胞过程和细胞器对可用氧气的竞争会影响肌红蛋白的氧化还原稳定性和MMb 的减少（Ramanathan等人 ， 2009）。第XI节 - H描述了分离线粒体的方法 ，第XI-I节描述了测量线粒体耗氧率的方法。
此外，骨骼肌的线粒体含量因生理来源不同而存在差异，导致相对耗氧率（OCR）、 肌红蛋白氧化还原形态 在表层与深层的分布，以及肉色稳定性等方面存在差异。新鲜肉类在储存和展示过程中保持“鲜红”状态的能力也存在差异。
肌肉（阿特金森和福莱特，1973；胡德，1980；奥基夫和胡德，1982；雷内尔和拉巴斯，1987；曼奇尼和亨特，2005）研究表明，线粒体含量较高的肌肉通常具有更高的氧化钙释放率（OCR），并能形成更多线粒体膜结合蛋白（MMb）。同样地，色素流失较快的肌肉往往颜色稳定性较差且OCR值较高（奥基夫和胡德 ，1982；雷内尔和拉巴斯，1987）。阿特金森和福莱特（1973）还指出，骨骼肌OCR值与色素流失速率呈正相关——OCR值越高，色素流失速率越快。通过测量OCR值，可以评估不同生理来源的尸体骨骼肌线粒体活性及其相对颜色稳定性。
肉类科学家已开发出多种客观检测方法来测定肌肉耗氧量和氧化偶联反应（OCR），包括瓦尔堡烧瓶法（Urbin和Wilson，1961）、差示呼吸测定法（DeVore和Solberg，1975）、克拉克氧电极法（Lanari和Cassens，1991；Ramanathan等，2009）、反射光谱法（Madhavi和Carpenter，1993）以及顶空氧分析仪（Sammel等，2002）。光线与肉类色素的相互作用为利用近红外（NIR ；700-1000纳米）技术检测肌红蛋白（Mb）的氧化还原动态提供了新思路。近期，Mohan团队（2010a）采用频域多距离（FDMD）NIR组织血氧仪，实现了对骨骼肌中肌红蛋白氧饱和度和OCR的实时、无创、直接测量。
7. 降肌红蛋白活性（MRA）。
测定MMb所用的方法学不同研究者对肉类活性降低（MRA）的评估存在显著差异（参见综述文章）（Bekhit和Faustman，2005）。测定 MRA 最常用的方法是首先诱导MMb的初始水平较高（通常通过在1%O大气或亚硝酸盐诱导氧化包装），随后进行促进MMb还原的检测步骤。通过分析肌肉中总MMb含量在还原步骤中的变化，可评估肌肉的还原能力。然而，肉类颜色研究者常质疑MMb含量变化呈现与解读的最佳方法是否可靠。
曼奇尼等人（2008年）研究了展示后 MRA 值在表层与深层区域的差异，并比较了包装氧浓度对这些区域差异及 MRA值的影响。他们还考察了还原甲基甲基溴（MMb）的四个测量指标——初始MMb形成量（IMF）、还原后MMb量（PRM）、绝对还原量与相对还原量 ——与颜色稳定性之间的关联。研究发现，这四个MMb/ MRA测量指标与可见表层颜色稳定性数据呈现正相关。研究者指出，不论是表层肌肉 还是 深层还原活性测量值，均未与表层颜色稳定性存在相关性。
他们发现，在他们的研究中使用的所有肌肉中，在牛排表面测量的传统绝对和相对 MRA 值与表面颜色的相关性最低 。
福斯特曼和卡森斯（1990年）同时报告了绝对有氧还原活性（ARA）和相对有氧还原活性（MRA）。奥基夫与胡德（1982年）提出，由于不同肌肉组织形成表面肌膜（MMb）的能力存在差异，相对 MRA 在预测肌肉颜色方面不如绝对 MRA 准确。麦肯纳等人（2005年）发现，当样本置于1%二氧化氧环境中时，部分肌肉组织会抑制表面肌膜的形成。他们通过诱导表面肌膜形成抵抗性（RIMF）指标，将肌肉还原能力与颜色稳定性相关联。
萨梅尔等人（2002年）的研究表明，一氧化氮对MMb的还原能力可用于测定还原活性。该研究团队指出，由于其方法最初采用温和氧化剂（硝酸钠）， 相较于使用铁氰化物的检测方法，这种方法可能为确定MRA 值提供了更实用的解决方案。金等人（2011年）沿用萨梅尔团队（2002年）的方法，监测 牛里脊肉排 在不同个体间的色泽稳定性差异。 研究发现，初始肉排耗氧速率 、经亚硝酸盐处理后的初始MRA值以及还原后MMb含量，是评估单个肉排色泽稳定性的关键指标。
第十一节 - J部分描述了一种测定完整肌肉切片中MMb还原能力的检测方法 ，该方法改编自Watts等人（1966年）的研究。具体操作时，将样本置于亚硝酸钠溶液中浸泡20分钟，使样本表面的肌肉色素首先被氧化生成MMb。随后将厚度为1.27厘米的切片真空包装，在30℃环境下通过测量 K/S 反射率比值（572/525纳米波长）持续监测表面MMb浓度，持续2小时。样本的还原能力定义为孵育期间表面MMb浓度的百分比下降值。第十一节-K部分则详细说明了对第十一节-J部分的改进方案，用于测定绞肉样本的MRA值（Sammel等人，2002年）。
第XI-L节描述了肌肉匀浆中 MRA 的快速（2分钟）测定法（Hagler等人，1979；Madhavi和Carpenter，1993年修改）。
将肌肉滤液+ NADH加入 荧光光度计比色皿中的MMb+铁氰化物 溶液中，启动反应。 在反应初始线性阶段（1至2分钟）内，通过OMb在580nm处吸光度的增加监测MMb还元酶活性。
8. 添加底物对 MRA（乳酸、苹果酸）的影响。
多位研究人员已对通过内源性酶系统促进MMb还原生成尼古丁酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的潜力产生兴趣，包括生化过程可能有助于维持肉品色泽稳定性。沃茨等人（1966）证实添加NAD可提升肉品的MRA值。当使用琥珀酸或细胞色素c c等底物时，电子传递过程可将这些物质转化为NAD。在特定底物条件下，细胞质中的多种脱氢1965能生成NADH。吉丁斯（1974，1977）提出线粒体或亚线粒体颗粒可参与还原肉品中的甲硫胺素（MMb），并推测线粒体通过提供关键还原辅因子 还原型 NADH（该物质既可由内源酶生成，也可通过逆转电子传递过程产生）来实现这一还原作用。
最近，Kim等人（2006）和Mohan等人（2010b）证明了添加从糖酵解（乳酸）或线粒体三羧酸途径（苹果酸）中获得的底物的效果。两项研究均报告了在向 完整肌肉或骨骼肌匀浆 中添加底物后，肉类的 MRA 得到改善。
B. 熟肉研究
肉类色素（肌红蛋白、血红蛋白）在烹饪过程中会发生变性，导致球蛋白结构解折叠。在有氧条件下，血红素铁极易被氧化，暴露的血红素可能与变性蛋白质形成复合物，包括肌红蛋白二聚体或聚集体（Tappel，1957；Ledward，1971）。这些灰褐色复合物被称为变性球蛋白半色素，其中“半”表示血红素铁处于氧化状态。尽管加热肌红蛋白（Mb）溶液时已采用可见光吸收光谱法，但研究熟肉色素时通常采用反射光谱法（Ledward，1971）。第XI-M节描述了一种检测需氧烹饪肉类（>76°C）中粉红色变性球蛋白半色素的反射光谱方法。需注意及时进行分析，因为这些色素在空气中会迅速褪色（Ghorpade和Cornforth，1992；Cornforth，2001）。
1. 持续性粉红现象与过早褐变——诊断方法。
消费者有时会对熟肉的粉红色感到敏感，怀疑产品可能未煮熟。因此，加工厂需要定期检测产品以确定 并消除或减少不希望出现的粉红现象。食材中亚硝酸盐或硝酸盐的污染 可能是导致粉红现象的原因之一（希顿等人，2000年）。可通过霍恩西（1956年）腌肉色素检测法进行排查（详见第XI-E和XI-F节）。 烤肉表面的粉红现象也会因接触燃烧废气中的二氧化氮而呈阳性反应（科恩福斯 等人，1998年）。燃烧废气中可能含有二氧化碳，但霍恩西（1956年）方法仅能检测NO-血红素复合物，无法识别CO-血红素复合物。
如果肉确实未煮熟，未变性的肌红蛋白含量将高于正常水平。肌红蛋白在pH>6.0时对热变性具有抵抗力，导致熟肉中的肌红蛋白浓度高于正常水平，并在内部温度达到80°C或更高时呈现红色或粉红色（Trout，1989；Moiseev和Cornforth，1999）。在另一个极端，Hague等人（1994）、Lavelle等人（1995）和Hunt等人。
(1999) 描述了氧化绞肉的过早褐变， 在烹饪过程中MMb变性的温度低于OMb或DMb 。 汉堡肉的过早褐变有食品安全影响，因为肉饼可能被视为在无法杀死食物病原体的烹饪温度下完全煮熟。
可溶性肌红蛋白可在磷酸盐缓冲液中提取，并如第XI - D节所述，使用分光光度计在525 nm处测量吸光度，即肌红蛋白的等渗点。根据物种和内部烹饪温度，煮熟的样品中可能残留部分可溶性肌红蛋白。pH值 > 6 . 0的肉类中可溶性肌红蛋白含量会高于正常水平。另一方面，过早褐变的肉类可溶性肌红蛋白含量低于正常水平，可能与低pH值有关。确定产品的pH值（第XI - B节）。
若未变性肌红蛋白或熟肉色素导致的粉红色无法确认，则应怀疑存在变性血红素色素。这些粉红色色素在罐装或慢炖锅烹饪等缺氧高温条件下形成，且需在水下进行。具体检测方法可参照第XI-M节 。
c. 熏制肉类研究
本节阐述了检测与定量分析熟肉及腌制肉色素及前体化合物的实验室方法。腌制肉通常添加亚硝酸钠或亚硝酸钾、硝酸盐进行配方处理，烹饪时会生成粉红色的腌制肉色素（单亚硝基血红素）。天然腌制肉中，腌制剂多为芹菜籽粉或海盐中的硝酸盐成分。 在烹饪前 ，通过微生物发酵将硝酸盐转化为 亚硝酸盐 。传统火烤干肉或烧烤肉制品中，一氧化氮气体在燃烧时会与湿润肉表面的水分反应生成亚硝酸根离子，从而引发烹饪过程中的表面粉化（腌制）现象。
1. 腌制肉着色剂。Erdman和Watts（1957）开发了一种有效的方法，通过监测570/650波长的表面反射率来跟踪腌制肉颜色的变化。该测量方法可用于指示真空泄漏包装或其他促进颜色褪色的条件 。
经固化处理的肉色素经基尔德等人鉴定为单硝基血红素。al.（1988年）通过质谱分析证实， 硝基化血红素的质量增加了30，这表明结合了一个NO基团（与先前报道的两个不同，如此）。作为血红素色素总量的百分比，用以衡量腌制工艺效果的 腌制肉色素含量（霍恩西，1956年）。由于血红素色素本身是与热使蛋白质变性形成的复合物，因此无法直接溶解 。 但 该NO基团可通过80%丙酮（根据样品含水量调整浓度）萃取，并通过540纳米波长的光谱分析进行定量（详见第XI-E和XI-F节）。
2. 总血红素和血红素铁含量。
总血红素含量可通过以下方法测定：将所有含血红素基团的物质萃取至80%酸化丙酮中，包括固化与未固化的色素，以及含血红素的酶类和辅因子（详见第XI-E和XI-F节）。
总血红素含量（以血红素计）通过A 640 法测定（Hornsey，1956）。固化过程中将血红素色素转化为亚硝基血红素形式的转化率低于80%通常被认为是可接受的（Pearson和Tauber，1984）。在Hornsey（1956）方法中，将10g样品混合在高烧杯中以防止过度蒸发。
皮尔逊和陶伯（1984）采用2克样品和带盖试管以防止通过蒸发处理，可同时分析更多样本。Carpenter和Clark（1995）采用5克样本。
使用Hornsey（1956）方法进行总血红素测定可评估肉类中血红素铁含量的营养价值（Carpenter和Clark，1995）。 湿法灰化后肉样中的总铁含量可通过铁嗪法测定（Carter，1971），其中 Fe²⁺ 与铁嗪结合形成红色色素，通过562nm波长的光谱法检测。非血红素铁含量可通过铁嗪法检测HCl-三氯乙酸提取物中的铁含量（Schricker等，1982）。不锈钢探针型匀浆器不宜用于盐酸 - TCA 中的样品匀浆，因为铁会从探针本身被提取，尤其是较旧、磨损的探针（Jayasingh，2004）。
3. 帕尔马火腿的红色素。
帕尔马火腿是意大利帕尔马地区传统发酵肉制品，通过长时间腌制猪后腿制成，且不添加硝酸盐或亚硝酸盐类腌制盐。莫里塔等人（1996）采用电子自旋共振光谱技术发现，帕尔马火腿的红色素与亚硝酸盐腌制肉的色素存在差异。他们进一步证实，从帕尔马火腿中分离出的葡萄球菌能从MMb（肌红蛋白）衍生出红色肌红蛋白。若松等人（2004）通过光谱分析、荧光检测，并运用HPLC 质谱和电喷雾电离高分辨质谱（ESI - HRMS）对帕尔马火腿的鲜红色素进行表征。 研究发现，这种红色 色素源自锌原卟啉IX，而非含铁血红素色素。
一氧化碳可使用非分散红外分析仪进行检测。该仪器通过两个独立能量源产生红外辐射。经斩波器调制的辐射脉冲频率为5赫兹，通过光学滤光片可有效抑制其他红外吸收物质的干扰。每束红外光束均通过独立检测池，其中一个检测池密封设计用于盛放标准气体。
另一单元则持续通入样品气体（CO），吸收的红外辐射量与CO浓度成正比 。
D. 包装尺寸
由于新鲜肉和加工肉的颜色受到与血红素结合的配体的深刻影响，而且包装在商业上用于最小化新鲜肉和加工肉的颜色变坏，包装在实验室分析中需要特别考虑。以下是分析期间包装样品的重要考虑因素。
1. 薄膜厚度。能够以密尔（1/100英寸；参见术语表）为单位测量厚度的数字式测微计，可用于测量薄膜和包装托盘的厚度。许多真空包装袋的厚度为2至3密尔，而用于新鲜零售肉类的氧气渗透性聚氯乙烯（聚氯乙烯）薄膜覆盖层通常厚度小于1密尔。一般来说，薄膜厚度越大，气体渗透性越低。较厚的薄膜也更昂贵。
2. 薄膜渗透性。对于鲜肉而言，高氧渗透性薄膜可维持氧合血红素色素（Landrock和Wallace，1955；Cornforth和Allen，2009）。极低氧渗透性薄膜（也称为高阻隔膜）会促使脱氧血红素色素的形成，因为肉的还原能力（Siegel，2007）。
当氧气分压较低（1至25毫米汞柱）时，会加速氧化反应并导致色素褐变（Kropf，2004），这种情况应尽量避免。表10.1展示了真空度从零（真空状态）到1个大气压（760毫米汞柱）时，不同真空度下大气压与氧气分压的变化 。其中特别标注了多数快速褐变的危险区域。使用常规真空包装机很难将氧气含量降至该范围以下，因此 肉类在消耗包装内残留氧气前 往往会 产生多聚肌肽（MMb）。相比之下，微气泡包装技术能通过 一次或多次向包装腔注入目标气体，比真空包装更有效地降低残留氧气水平。无论采用何种包装系统，都需谨慎控制以确保氧气分压足够低。
氧气，以确保肉质消耗残留氧气的能力不会被超出。
无论包装内真空度如何，残留气体的成分比例始终与空气基本一致：氮气78.1%、氧气20.9%、氩气0.9%、二氧化碳0.03%。不过，像氧气电极这样的传感器检测到的气体浓度，其实与产品周围的大气压成正比。举个例子，当真空度达到大气压一半时，可测得的氧气浓度为10.45%（104,500ppm），此时氧气分压为79.6毫米汞柱（380/760×159.2毫米汞柱；见表10.1）。包装膜的透气性对抑制氧气渗入同样关键，尤其是出口产品这类保质期较长的商品，更需要严防死守。
包装薄膜、袋子、和托盘的气体渗透性通常包括 水蒸气和氧气的渗透率。二氧化碳、一氧化碳和氮气的渗透率数据较少。
渗透率不仅随薄膜厚度变化，还受其他因素影响。研究报告应包含薄膜渗透率的相关信息。
3. 改良大气包装技术。 高氧阻隔包装膜可 结合多种顶空气体，有效调控并保存肉类中的色素形态。二氧化碳因其抗菌特性在改良大气包装中应用广泛。但氮气与二氧化碳对色素形态基本无影响，因此它们存在于改良大气包装顶空时不会改变肉品色泽（Moeller等，2004）。高氧环境有助于维持氧合血红素色素形态（Georgala和Davidson，1970；O‘Sullivan和Kerry，2010），但需注意肉品的呼吸能力，避免氧气消耗过量导致甲基甲蓝（MMb）生成（Bekhit和Faustman，2005）。若包装顶空存在一氧化碳或一氧化氮气体，或使用含亚硝酸钠晶体的包装膜，会形成反映这些化合物结合的色素形态（Siegel，2007,2009）。
4. 包装气体成分检测。 为验证MAP系统能否达到目标气体成分并确保储存期间成分稳定，需对包装内气体成分进行检测报告。由于肉类呼吸作用和气体吸收 ，MAP系统中的相对气体成分在包装保质期内会发生动态变化；因此，需要精准确定采样时间。通过自密封隔膜用注射器抽取包装样本，可借助顶空气体分析仪测定氧气、一氧化碳和二氧化碳浓度（Knock等人，2005；Mancini等人，2009 ；Raines和Hunt，2010）。
e. 脂质氧化对肉品色泽（新鲜、熟成、腌制）的影响
多数肉类色泽研究都会检测脂质氧化指标 ， 因为肌红蛋白氧化通常与脂质氧化密切相关 。 脂质氧化产生的醛类物质会引发肌红蛋白构象变化 ， 导致血红素氧化加剧并产生褐变（Alderton等，2003）。鱼类血红蛋白在储存过程中释放的血红素同样会刺激脂质氧化（Grunwald和Richards，2006）。类似地，加热过程中从血红素中释放的离子态铁也可能刺激脂质氧化 ， 这可通过硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）检测法进行测量（Igene等，1985）。脂质氧化程度可通过多种技术手段测定，包括挥发性氧化产物顶空分析（Watanabe等，2008）和感官评价，但在肉类制品中最常用的是 TBARS 检测法。TBARS检测法基于硫代巴比妥酸与脂质氧化醛产物（尤其是2,4-亚烷基二醛）反应生成粉红色显色剂的原理，该显色剂在530-535纳米波长处具有最大吸光度（Marcuse和Johansson，1973）。丙二醛（MDA）是用于 TBARS 标准曲线的化合物。该检测法可对多个样本进行快速检测，1天内即可得出结果，且 TBARS 值与感官测试结果高度相关。当 TBARS 值>1.0时，通常表明煮熟的肉样存在可检测的氧化性气味和风味（Greene和Cumuze，1981）Tarladgis等人（1960）开发了广泛使用的蒸馏法（第十一节 - P）， 具体操作是将 硫代巴比妥酸（TBA）溶液加入样品冷凝液中。为简化蒸馏步骤，可直接将TBA溶液加入肉样中，对未加热样本需等待数小时 使显色剂形成（Witte等人，1970），或如第XI-O节所述，通过10分钟煮沸处理（Buege和Aust，1978）。
在 TBARS 检测中，当存在大量脂类衍生醛类（Marcuse和Johansson，1973）及糖类（包括蔗糖，Du和Bramlage，1992）时，也会产生最大吸光度为453 nm的黄色显色剂。为消除糖类引发的黄色干扰，Du和Bramlage（1992）开发了改良方法，采用MDA和蔗糖的标准曲线进行校正。另一种解决方案是采用Tarladgis等人（1960）的原始蒸馏法处理含葡萄干（含糖量70%）的肉样，由于糖醛类化合物不挥发，不会被样品冷凝液捕获，从而避免了黄色显色现象（Vasavada和Cornforth，2006）。
在腌制肉制品中， TBARS 值会受到残留亚硝酸盐的影响。为此，Zipser和Watts（1962年）改进的 TBARS 测定法会在 蒸馏前向腌肉样品中添加磺胺类化合物，以防止残留亚硝酸盐引发丙二醛亚硝化反应导致的误判 。但值得注意的是，磺胺类化合物的添加本身也会改变 TBARS 值。实验数据显示，当亚硝酸盐浓度为100-200ppm时，添加磺胺类化合物的腌肉 TBARS 值始终高于未添加组。然而在0-50ppm的低浓度亚硝酸钠条件下，磺胺类化合物的存在反而会使 TBARS 值持续降低（Shahidi等，1985年）。
F. 基础研究方法
1. 肌红蛋白的质谱表征技术。肉品色泽稳定性受多种内在与外在因素影响，包括物种特异性差异、红白肌纤维分布特征及肌红蛋白化学特性。 质谱分析作为蛋白质结构表征的关键工具，在肉类科学领域已展现出在肌红蛋白功能特性研究中的巨大应用潜力。为探究肉品色泽的物种特异性差，Joseph等人（2010a）采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术开展研究。
采用质谱法对野牛肌红蛋白进行表征；约瑟夫等人（2010a）对火鸡肌红蛋白进行表征；苏曼等人（2010）对鸸鹋肌红蛋白进行表征。
蛋白质和肽是肌肉食品的主要成分，对烹饪过程中食品蛋白质的结构变化至关重要。食品蛋白质组学已开始影响食品链的诸多环节，包括食品生产、食品安全和质量控制。近年来，质谱技术的应用彻底改变了蛋白质特征分析、氨基酸测序以及细菌蛋白质指纹图谱的研究。 蛋白质组学的最新 进展为肉类科学家提供了新机遇，使他们能够深入探究食材相互作用的分子机制，从而优化肉类色泽及其稳定性研究。
曼奇尼团队（2010年）运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术，揭示了乳酸影响牛肉色泽稳定性的作用机制。通过质谱分析，科研人员能够系统研究原料间的相互作用、加工过程引发的改变，并精准定位食品链中最易出现质量问题、微生物污染和营养流失的环节。尽管食品蛋白质组学在肉类科学领域尚属新兴领域，但这项技术已为改善人类健康作出重要贡献 。
2. 氧代谢检测技术用于测定包装肉中肌红蛋白形态的相对浓度。 肉类色泽的生化因素研究已持续数十年，但鲜有研究聚焦于开发非侵入性方法 / 技术，以快速实时评估肉类整体品质。尽管该领域已取得显著进展，现有表征肉色参数和预测肉色稳定性的技术 仍存在局限性——这些方法具有侵入性、耗时费力且仅能间接反映肌红蛋白的氧化还原状态。类似地，用于表征组织结构的检测技术（如耗氧量和线粒体活性相关技术）也存在相同缺陷。肉类中光与肌肉色素的相互作用为开发近红外（NIR）检测肌红蛋白氧化还原动态的方法提供了新思路。700至1000纳米技术。
近红外光谱（NIRS）已被广泛用于 医学诊断和运动生理学中确定肌红蛋白和血红蛋白的氧吸收（Ferreira等人，2005）。 NIRS 是一种无创、连续和快速（25至35秒）评估肉类表面和亚表面水平氧合和脱氧肌红蛋白绝对浓度的方法（Mohan等人，2010a）。
基于 NIRS 光-组织相互作用的基本方法 能实时提供关于肉类光学特性和吸收模式的宝贵信息，同时定量分析肉表面及次表层的肌红蛋白氧化还原形态。由于 NIR 光能深入穿透如肉类等生物组织，NIRS 技术有望成为非侵入性大视场成像 死后肌肉研究的有效手段。 由于肌红蛋白与血红蛋白在 NIR 波段吸收波长相同， 同一方法也可用于测定 肉类肌红蛋白的氧化还原稳定性及其他结构特征，这将最终帮助我们理解后处理工艺对肌红蛋白化学性质的影响。
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